raf-mek-erk信号转导通路在肿瘤中的研究进展

raf-mek-erk信号转导通路在肿瘤中的研究进展

raf是raf信号通道信号的重要组成部分。这一通路是促丝裂原蛋白激酶(MAPK)通路中的一种,其将胞外信号如生长因子、细胞因子和激素等传递入细胞核,引起相关基因的转录,从而调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡。Raf家族由3个亚型构成:A-Raf、B-Raf和C-Raf(即Raf-1)。其中,B-Raf在人类肿瘤中起着重要作用,在多种人类肿瘤中均发现了突变的B-Raf,其在黑色素瘤中的突变率为66%,甲状腺癌中为36%,卵巢癌中为20%,结直肠癌中为10%。B-Raf绝大部分突变形式为B-RafV600E,即该酶激活片段600位的缬氨酸被谷氨酸所取代,这种突变可致酶活性提高约500倍,可持续激活下游的信号级联效应器MEK和ERK,导致这条信号通路的持续激活,对肿瘤的发生、生长增殖和侵袭转移至关重要,现已成为抗黑色素瘤等突变肿瘤的有效作用靶标之一。由此,众多医药公司相继开发了多种B-Raf激酶抑制剂(见表1)。根据抑制剂与激酶作用的不同方式,可将B-Raf激酶抑制剂分为Ⅰ型和Ⅱ型两类。Ⅱ型抑制剂优先与激酶的非活性构象结合,如索拉菲尼(代号:BAY43-9006,商品名:多吉美,1)、瑞戈菲尼(regorafenib,2),而Ⅰ型抑制剂在活性构象中靶向于ATP结合位点,如威罗菲尼(代号:PLX4032/RG7204,商品名:ZelboRaf,3)、dabrafenib(代号:GSK2118436,商品名:Tafinlar,4)、PLX4720(5)和SB-590885(6)。尽管这些药物在临床上都表现出可喜的疗效,但也有许多不足,引发耐药性就是问题之一。下面将重点介绍已上市的B-Raf激酶抑制剂及其引发肿瘤耐药性的机制。1临床常用b-raf激酶抑制剂1.1治疗晚期肺癌索拉菲尼由拜耳公司和Onyx公司联合开发,是首个获准的口服多靶点抗肿瘤药物。本品于2005年12月获美国FDA批准用于晚期肾癌的一线治疗,于2007年11月获准用于治疗晚期肝癌,又于2013年11月获准用于甲状腺瘤。其能抑制多种激酶的活性,包括Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、KIT和FLT-3等。作为Ⅱ型B-Raf激酶抑制剂的代表药物,索拉菲尼用于肾癌患者,总生存期仅延长2~3个月,客观缓解率(ORR)低于10%,肝癌患者使用本品后的中位总生存期(OS)也仅为10.7个月。虽然索拉菲尼能适当延迟症状恶化的时间,但长时间使用可导致肿瘤产生耐药性,严重影响疗效。1.2试验抑制剂—威罗菲尼威罗菲尼是由罗氏/Plexxikon制药公司开发的可用于治疗不可手术或转移性的抗黑色素瘤药物,于2011年8月17日获美国FDA批准上市,该药为一种口服有效的B-RafV600E激酶Ⅰ型强效抑制剂。在携带突变型B-RafV600E的黑色素瘤细胞中进行的研究显示,威罗菲尼可通过阻断B-RafV600E/MEK/ERK通路起到抑制细胞增殖的作用,而对携带B-RafWT的黑色素瘤细胞无效。起初,使用威罗菲尼的患者其病情有所缓解,但该药的长期疗效并不理想——大部分用药者最终疾病复发,并发展成耐药且致死的黑色素瘤。DasThakur等发现,黑色素瘤细胞对威罗菲尼产生耐药性的机制,促使肿瘤细胞对该药产生了依赖性。其结果是,黑色素瘤细胞利用威罗菲尼刺激自身快速生长,进而发展为耐药和致死性肿瘤。1.3/期临床试验Dabrafenib是由葛兰素史克公司开发的一种选择性B-RafV600E激酶Ⅰ型抑制剂,于2013年5月29日获美国FDA批准上市,用于不可手术或转移性的黑色素瘤。研究显示,对许多患者而言,dabrafenib的疗效持续时间短,原因是肿瘤细胞产生了耐药性。目前,将dabrafenib与MEK抑制剂trametinib(代号:GSK1120212,商品名:Mekinist)联合用药的Ⅰ/Ⅱ期临床试验已经完成。研究人员将162名携带B-RafV600E的黑色素瘤患者随机分为3组,分别给予dabrafenib(150mg,bid)、dabrafenib(150mg,bid)+trametinib(1mg,qd),以及dabrafenib(150mg,bid)+trametinib(2mg,qd)。结果发现dabrafenib(150mg,bid)+trametinib(2mg,qd)组患者的无进展生存期明显高于dabrafenib(150mg,bid)组患者(9.4vs5.8个月);在dabrafenib(150mg,bid)+trametinib(2mg,qd)组中,12个月肿瘤无进展的患者比例为41%,而在dabrafenib(150mg,bid)组中这项数据仅为9%。基于上述研究结果,FDA于2013年9月授予dabrafenib/trametinib联合用药的优先审查资格。2b-raf剂的抗剂活性机制随着肿瘤细胞对B-Raf激酶抑制剂耐药性的出现,近年来,研究人员努力探寻与耐药相关的具体机制,以期能找到新的治疗手段。2.1ras突变激活相关研究进展研究表明,对威罗菲尼、dabrafenib、PLX4720和SB-590885等Ⅰ型抑制剂产生耐药的机制主要包括以下2种途径:一种途径为肿瘤细胞通过COT(由MAP3K8编码)、NRAS、p61B-RafV600E、MEK等突变体重新激活ERK磷酸化,另一种为激活细胞膜表面酪氨酸激酶受体(RTK),建立不依赖于ERK磷酸化的生存途径(见图1)。2.1.1COT过表达Johannessen等研究发现,COT激酶过表达可激活MAPK通路,导致肿瘤细胞对PLX4720耐药。该课题组通过表达约600种激酶及其相关的开放阅读框来研究选择性B-Raf激酶抑制剂的耐药机制,最终确证,MAP3K8(编码基因为COT/Tpl2)作为MAPK通路的激活因子,可促使B-RafV600E细胞株对B-Raf抑制剂产生耐药性。COT通过依赖MEK的方式激活ERK,而不需要Raf信号。黑色素瘤复发患者使用MEK或B-Raf抑制剂后肿瘤细胞组织所产生的耐药性,以及PLX4720体外诱导B-RafV600E细胞株产生的耐药性,均与COT的过表达有关。研究表明,通过联合用药的方式(例如B-Raf/MEK抑制剂的组合或B-Raf/COT抑制剂的组合),有望抑制肿瘤耐药性的产生。2.1.2NRAS突变激活Nazarian等研究发现,RAS激酶亚型NRAS的突变体——NRAS(Q61K)的激活可引起肿瘤细胞对威罗菲尼的获得性耐药,而不需通过B-RafV600E的二次突变来实现。上述发现在体外耐药性诱导实验中得到了证实:肿瘤细胞经威罗菲尼处理后,产生高活性的突变体NRAS(Q61K),突变的NRAS(Q61K)再激活C-Raf,从而重新激活MAPK信号通路,导致耐药性产生。与此同时,NRAS突变的肿瘤对MEK抑制剂保持敏感性。敲除NRAS后,耐药的细胞系生长减缓。此外,在来自黑色素瘤患者、对威罗菲尼耐药的B-RafV600E阳性细胞亚系中进行的研究亦证实了NRAS突变激活在肿瘤耐药性产生过程中的重要作用。2.1.3B-RafV600E突变体的表达和MEK突变Poulikakos等研究发现,对威罗菲尼耐药的SKMEL-239细胞株可表达一种B-RafV600E突变体(其相对分子质量为61000,也称p61B-RafV600E突变体),该突变体缺少外显子4—8区域(该区域包含了RAS结合结构域),从而表现出低水平的RAS激活能力。与完整的B-RafV600E相比,p61B-RafV600E的二聚体形成能力增强,可重新激活ERK信号,导致细胞对B-RafV600E抑制剂耐药。在产生p61B-RafV600E的细胞内,B-Raf抑制剂无法抑制ERK信号的传导,而通过突变不再产生p61B-RafV600E的细胞,则重新恢复对威罗菲尼的敏感性。最后,Poulikakos等研究发现,19名因使用威罗菲尼而产生耐药的肿瘤患者中,有6名体内表达p61B-RafV600E。通过对相关数据进行分析,课题组确证了这种新的获得性耐药机制——p61B-RafV600E表达,并以不依赖于RAS的方式二聚化。Wagle等在1名对威罗菲尼早期应答显著、后期产生耐药的患者肿瘤样本中,前后对比发现了MEK1点突变C121S,这一突变增加了MEK1活性,导致肿瘤对B-Raf和MEK抑制剂耐药。2.1.4血小板衍生生长因子受体β途径血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)的过表达可引起肿瘤耐药性的产生。Nazarian等在体外诱导的对威罗菲尼耐药的细胞中检测到PDGFRβ过表达且活性增加,以及激活RTK磷酸化途径中相关酪氨酸的磷酸化。当敲除PDGFRβ后,对威罗菲尼耐药的细胞系的生长减缓。提示,PDGFRβ过表达使得对威罗菲尼敏感的肿瘤亲本细胞系产生耐药。2.1.5胰岛素样生长因子受体途径Villanueva等报道了一种对SB-590885耐药的黑色素瘤细胞株,该细胞株对其他选择性B-Raf抑制剂交叉耐药,其耐药机制为Raf激酶3种异构体的灵活变构。运用p-RTK芯片分析鉴定出胰岛素样生长因子受体(IGF-1R),IGF-1R不仅能通过任意一种Raf亚型激活MEK-ERK,还可以激活PI3K/AKT等与细胞增殖和凋亡密切相关的信号通路。耐药细胞中IGF-1R/PI3K信号增强,而联合使用IGF-1R/PI3K和MEK抑制剂可诱导耐药细胞死亡。在肿瘤复发病人体内可见IGF-1R和pAKT表达水平增加,进一步确证了上述耐药机制。2.1.6EGFR代偿性激活对于近10%携带B-RafV600E的结直肠癌患者而言,目前暂无有效的靶向治疗方案。研究人员发现,威罗菲尼虽能抑制结直肠癌细胞内的B-Raf活性,但长时间使用会引发表皮生长因子受体(EGFR)的代偿性激活,为癌细胞生长提供源源不断的能量。黑色素瘤中也可发生同样的代偿反应,但该肿瘤细胞内EGFR水平过低,不足以抵消B-RafV600E的封闭,因而不会发生耐药。这些发现提示,携带B-RafV600E突变体的结直肠癌患者或可从靶向B-Raf和EGFR的药物的联合用药方案中获益。2.2emt在肺癌细胞耐药中的作用针对索拉菲尼这种Ⅱ型抑制剂的研究表明,肿瘤细胞中存在多种旁路机制,促使其对索拉菲尼产生获得性耐药。2.2.1磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B通路磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和MAPK通路在肝癌组织中被激活或过度表达的比例很高。PI3K/Akt通路与MAPK通路之间存在交叉(crosstalk),两条通路上游均为RAS激酶,当索拉菲尼靶向抑制酪氨酸激酶与MAPK通路时,并行的PI3K/Akt通路并不受影响,这种潜在的代偿机制导致肿瘤对索拉菲尼耐药性的产生。Chen等研究显示,在长期给药后导致对索拉菲尼耐药的肝癌细胞中,磷酸化的Akt和p85蛋白过度表达。同样,Akt异构表达的肝癌细胞也表现出对索拉菲尼的耐药性。此外,当敲除Akt基因或使用Akt抑制剂MK-2206时,肿瘤细胞对索拉菲尼的耐药现象发生逆转。2.2.2Janus激酶/信号转导和转录激活因子通路Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)通路参与调控细胞增殖、分化、生存、迁移与凋亡。STAT3在基因转录调控中起着关键的作用,可被许多JAK激酶介导的生长因子受体(如PDGFR、FGFR、EGFR)和细胞因子激活。STAT3在肝癌细胞中被激活,敲除STAT3蛋白基因对肝癌细胞可起到增殖抑制作用。通过抑制Src同源蛋白酪氨酸磷酸酶(SHPS,如SHP-1和SHP-2),可负调控STAT。索拉菲尼以依赖SHP-1的方式对STAT3起到抑制作用。研究发现,对索拉菲尼耐药的肝癌细胞能过表达p-STAT3、p-JAK1和p-JAK2,而SHP-1和p-SHP-1的表达水平较低,提示JAK-STAT信号通路参与肝癌细胞对索拉菲尼的耐药性形成过程。2.2.3上皮细胞-间充质转化上皮细胞-间充质转化(EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,该过程参与胚胎发育和伤口愈合,并对癌症的转移与侵袭产生重要作用。EMT受上游通路(如MAPK、PI3K/Akt)调控。最新研究表明,EMT参与肿瘤耐药性的产生过程,而靶向EMT可扭转肿瘤的耐药性。EMT在肝癌细胞对舒尼替尼产生耐药性的过程中的作用已被报道。一项在肝癌细胞中进行的研究表明,索拉菲尼可通过MAPK信号下调锌指转录因子SNAI-1的表达,从而抑制肝细胞生长因子(HGF)诱导的EMT途径。上述研究表明,EMT可能参与肝癌细胞对索拉菲尼的耐药性形成过程,但具体的机制还有待进一步研究。除了上述机制,一些研究还表明,EGFR、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、多药耐药蛋白2(MDRP2)、NF-κβ、自噬