丝裂原活化蛋白激酶mapk在不同年龄小鼠卵母细胞中的表达及其与纺锤体和染色体构象的关系

丝裂原活化蛋白激酶mapk在不同年龄小鼠卵母细胞中的表达及其与纺锤体和染色体构象的关系

错误的卵圆和体组织与母体时代之间的相关性尚不清楚。有研究认为,在老龄个体的卵母细胞中,形成正常纺锤体所需的某些调控因子可能发生改变,从而引起卵母细胞纺锤体和染色体构象异常。丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)MAPK-1(P44ERK1)和MAPK-2(P42ERK2)是调节卵母细胞减数分裂的关键分子,在多种动物卵母细胞(包括小鼠、大鼠、猪、羊等)的成熟分裂中发挥作用,可诱导不同动物卵母细胞减数分裂的启动,或参与减数分裂后续事件的调控。对猪卵母细胞的研究发现,在体外老化的猪卵母细胞中,MAPK的活性随纺锤体和染色体构象异常率增加而显著降低,提示MAPK对于维持微管和染色体在减数分裂中的正常行为具有重要作用。鉴于MAPK在老化卵母细胞减数分裂中对于维持微管和染色体正常行为的重要作用,我们推测,MAPK也可能与高龄女性卵母细胞纺锤体和染色体构象异常有关。为了解答这一问题,本研究以小鼠卵母细胞作为研究对象,采用免疫细胞化学与激光共聚焦显微术相结合的方法检测了MAPK(ERK1/2)在不同年龄小鼠卵母细胞中的活性表达。数据和方法1.透明质酸酶激活剂genussp.k-ra实验动物为6～8和45～50周龄的雌性中国昆明小白鼠(购自同济医学院动物研究所)。小鼠饲养采用自由采食、饮水、人工控温(22～26℃)和控光(14h光照,10h黑暗)。腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG,10IU/只),46～48h后腹腔内注射人绒毛膜促性腺激素(hCG,10IU/只),14～18h后颈椎脱臼法处死小鼠,取出输卵管,置于含Gamete培养液(瑞典Vitrolife公司)的培养皿中,撕破输卵管壶腹,收集卵丘卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplexesCOC),在含80IU/ml透明质酸酶(美国Sigma公司)的Gamete液中轻轻吹打3～5min,脱去颗粒细胞,移入IVFTM～30(瑞典Vitrolife公司)培养液中,放入5%CO2、37℃培养箱中培养。于培养后2h收集处于MⅡ的成熟小鼠卵母细胞进行免疫细胞化学术。2.离体卵母细胞的制备纺锤体和染色体构象的免疫细胞化学参照Pickering等的方法进行。将小鼠卵母细胞移入2%甲醛和0.02%TritonX～100混合液中,37℃固定和透化胞膜30min。用含0.3%小牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)作为清洗液洗3次,放入加有0.5%胎牛血清的α微管蛋白单克隆抗体(购自武汉博士德公司),工作浓度为1∶100,37℃孵育45min或4℃过夜。清洗液洗3次后,将卵母细胞移入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(购自北京中山生物技术有限公司)中,工作浓度为1∶100,37℃避光孵育45min,清洗液洗3次,以去除未结合的抗体。最后将卵母细胞移入50μg/ml碘化丙啶(PI,美国Sigma公司)中复染15min,整装压片,在激光共聚焦显微镜(德国Leica)下观察纺锤体和染色体形态分布并摄片。卵母细胞ERK1/2蛋白的表达参照Fan等的方法进行。将小鼠卵母细胞移入新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中,37℃固定30min,而后放入0.5%TritonX-100中透化胞膜30min。用含0.3%BSA的PBS(清洗液)洗3次,放入磷酸化ERK1/2单克隆抗体(购自北京中杉金桥公司),工作浓度为1∶50,4℃过夜。清洗液洗3次后,将卵母细胞移入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(购自北京中山生物技术有限公司)中,工作浓度为1∶100,37℃避光孵育45min,清洗液洗3次,以去除未结合的抗体。在激光共聚焦显微镜(德国Leica)下观察ERK1/2的表达并测定ERK1/2蛋白表达的荧光强度。3.锤体染色异常纺锤体和染色体构象的评估参照Boisoetal的标准。正常情况下,纺锤体为两极对称的桶形,染色体紧密排列在赤道板上。纺锤体异常包括:两极距离缩短、极性异常、极性完全消失或缺如;染色体构象异常包括:个别染色体从赤道板上脱落、染色体失去正常的紧密排列结构、松散分布、凝结成块、模糊不清或缺如。4.统计方法计数数据采用χ2检验,计量数据采用配对t检验,以P<0.05作为显著性差异的标准。结果1.小鼠卵母细胞的纺锤体和染色体检查结果共检测54个年龄6～8周小鼠卵母细胞的纺锤体和染色体,其中正常纺锤体和染色体49个(91%),异常纺锤体和染色体5个,占9%。在检测的42个45～50周小鼠卵母细胞中,正常纺锤体和染色体为30个(71%),明显低于6～8周小鼠;异常纺锤体和染色体12个(29%),明显高于6～8周小鼠(P<0.025)(表1)。2.卵母细胞荧光强度ERK1/2在卵母细胞中沿纺锤体分布,在整个纺锤体上都有ERK1/2的表达。将小鼠卵母细胞按母体年龄分为两组(6-8周组和45-50周组),每组各测定20个卵母细胞的荧光强度。6-8周组卵母细胞的ERK1/2荧光强度为78.21±13.34;45-50周组卵母细胞的ERK1/2荧光强度为61.45±15.67,前者明显高于后者(P<0.05)。mapk在纺锤体和染色体构象异常中的活性纺锤体是由大量微管纵向排列组成的中间宽、两极小的细胞器,对于卵母细胞染色体的平衡、运动、分离和极体的排出具有重要作用。在分裂中期,两极的纺锤体微管分别同染色体的两个动粒(kinetochore)结合,装配形成染色体牵丝,在其作用下,染色体逐渐移向纺锤体的中心区,形成纺锤体赤道板。在分裂后期,染色体的动粒在染色体牵丝的作用下发生断裂,引起同源染色体或姐妹染色单体分离,分别移向两极。因此,正常的纺锤体和染色体构象是确保减数分裂正常进行和染色体正确分离的关键之一。Tarin等对小鼠卵母细胞的研究结果显示,高龄小鼠(40周)卵母细胞染色体构象异常率显著高于幼年小鼠(10～12周),而且前者卵母细胞的非整倍体发生率也明显高于后者。本组资料中6～8周小鼠卵母细胞纺锤体和染色体构象异常率显著低于45～50周小鼠,与Tarin等的结果一致。关于老龄小鼠卵母细胞中纺锤体和染色体构象异常率增高的原因至今尚未弄清,推测可能与卵母细胞中某些调控因子活性下降或失去作用有关。MAPK是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,又被称为细胞外信号调节激酶(extracellularregulatedkinase,ERK),是激素、生长因子、细胞因子和环境刺激等细胞外信号的中间传导物。MAPK在体细胞中广泛表达,通过其信号级联(MAPKKK/MAPKK/MAPK)将不同的细胞外信号传递至细胞核内,从而调控细胞周期。在生发泡期(germinalvesicleGV期)卵母细胞中MAPK以无活性形式存在,生发泡破裂(germinalvesiclebreakdownGVBD)之后被磷酸化激活,其活性在MⅠ期达顶峰并维持至MⅡ期。MAPK在空间上的分布与微管和染色质行为密切相关,本研究中,MAPK沿纺锤体的分布也证实了这一点。GVBD之后,MAPK参与了卵母细胞纺锤体的组装和维持染色体的正常排列。在猪卵母细胞体外老化过程中,MAPK的活性明显下降,这被认为是引起卵母细胞体外老化后纺锤体和染色体构象异常率显著增高的主要原因之一。目前关于MAPK在卵母细胞中的表达与母体年龄的关系尚未见报道。本研究以小鼠卵母细胞为研究对象,检测了MAPK在不同年龄小鼠卵母细胞中的表达。结果显示,高龄小鼠(45～50周)卵母细胞中的ERK1/2蛋白表达明显低于幼龄小鼠(6～8周)。MAPK是组成卵母细胞微管组织中心的功能成分之一,高水平的MAPK对于维持染色体的正常构象至关重要,其活性下降可导致微管组织中心功能改变和微管重构,切断纺锤体和染色体间的正常联系,引起染色体的排列不稳定。因此,MAPK的活性下降很可能是造成高龄小鼠卵母细胞纺锤体和染色体构象异常的重要原因之一。MAPK在减数分裂的调节中具有重要作用,它不仅是纺锤体的调控因子,而且是一种纺锤体监控点蛋白(spindlecheckpointprotein)。纺锤体监控点功能在于监控细胞分裂中期纺锤体的完整性和染色体的排列,只有当所有的染色体动粒都与一个或更多的纺锤体微管相连,所有的染色体都定位于赤道板上时,减数分裂才会从中期进入后期,否则减数分裂停滞,直到错误解除。因此,MAPK在高龄小鼠卵母细胞中的表达下降也提示,高龄个体卵母细胞纺锤体监控点的功能