山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠肾脏gf-

山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠肾脏gf-

糖尿病和肾病是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一，严重威胁着人类的健康。因此，有必要确定影响糖尿病和肾脏的有效方法和方法。目前西医防治糖尿病肾病中,药物副作用较大,因此我国广泛开展了中医中药对糖尿病肾病的防治研究。本实验以山楂叶总黄酮干预链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型大鼠,观察山楂叶总黄酮对大鼠肾脏TGF-β1/Smad4信号转导通路的影响。1材料和方法1.1syxk6-400选用正常Wistar大鼠60只,雌雄各半,体质量(200±20)g,由黑龙江省佳木斯大学动物中心提供,合格证号:(黑)SYXK2006-004。1.2试剂及仪器山楂叶总黄酮:晋城中晋药业有限公司,批号20071229;厄贝沙坦:赛诺非安万特(杭州)制药有限公司。链脲佐菌素:美国Sigma公司;RT-PCR试剂盒及相关辅助试剂:南京凯基生物科技发展有限公司;引物合成:北京奥科生物技术有限责任公司。血糖仪及试纸:美国强生公司;梯度PCR仪(Gradient型,Biometra公司);GIS凝胶成像分析系统(TanonGIS-1000)。1.4测试指标1.4.1血液测试1.4.224小时尿蛋白测定1.4.3血液中蛋白质和素氮的测定1.4.4病理形态观察1.5统计分析2结果2.1小鼠肝肾组织结构变化模型组血糖明显升高,肾功能下降,经山楂叶总黄酮治疗后血糖下降,肾功能改善。光镜下正常组肾小球结构完整,肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常,肾小管形状规则,未见肥大。模型组可见肾小球肥大,毛细血管基底膜增厚,系膜细胞增生,系膜区增宽,基质增多,肾小球细胞外基质的相对面积明显增大。肾小管扩张,上皮细胞肿胀空泡变性。各治疗组较模型组均有不同程度改善,山楂叶总黄酮组与阳性组肾小球细胞外基质的相对面积无明显差异(见表2)。2.2模型组表达不同的表达,模型组表达不同正常组大鼠肾组织可见TGF-β1、Smad4mRNA的表达,模型组的表达均明显增加。经山楂叶总黄酮治疗后大鼠肾组织TGF-β1、Smad4mRNA的表达均明显减少,山楂叶总黄酮组与阳性组无明显差异(见表3)。3山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠肾组织病理学的作用许多研究表明TGF-β1/Smad信号转导通路在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用,因此靶向TGF-β1/Smad信号转导通路寻找有效的治疗药物具有重要的临床和现实意义。山楂叶总黄酮具有改善心功能,增强心肌抵抗缺氧能力;降低血压、血脂;降糖;强大的抗氧化等作用。本实验结果表明山楂叶总黄酮可显著降低24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮,改善肾组织的病理变化。提示山楂叶总黄酮对糖尿病肾病模型大鼠具有明显的肾保护作用。糖尿病时高血糖、糖基化终末产物、血管紧张素II等都可以激活TGF-β1,它是一种多功能,能多向调节的细胞因子,是糖尿病肾病复杂的细胞因子网络中心的核心因子TGF-β1激活后与其受体结合,其受体复合物通过Smads蛋白将信号由细胞膜直接转移至细胞核内,诱导肾小球以及肾小管细胞肥大,促进肾小球细胞外基质积聚,抑制肾小球细胞外基质降解,从而引起肾间质纤维化,其中Smad4在信号转导过程中起瓶颈作用,是调控信号转导的关键因子,是TGF-β1/Smad信号转导通路中必不可少的家族成员。本实验应用RT-PCR法测定肾脏TGF-β1、Smad4的表达,结果显示山楂叶总黄酮可以下调TGF-β1、Smad4的表达,通过影响TGF-β1/Smad4信号转导通路,阻断糖尿病肾病大鼠肾脏中TGF-β1/Smad信号转导通路介导的肾小球细胞外基质积聚、肾小球肥大、肾小管上皮细胞的转分化以及肾间质的纤维化,从而减轻糖尿病肾病的病理改变,改善肾功能。1.3各组大鼠肾组织病理学检测大鼠适应性饲养1周,除正常组外其余所有大鼠喂高脂高糖饲料4周后,按25mg/kg一次性尾静脉注射2%链脲佐菌素注射剂,实验9周后测空腹血糖和24h尿蛋白(UPr)。取空腹血糖≥16.8mmol/L的大鼠重新分组,正常组正常饲料喂养,模型组、阳性组及山楂叶总黄酮组高脂高糖饲料喂养,阳性组厄贝沙坦氯化钠溶液3g/(kg·d),山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮200mg/(kg·d)固定时间灌胃给药,共12周。内眦静脉取血测血糖。考马斯亮蓝法测定。杀死大鼠前心腔穿刺取血,4℃离心分离血清,-20℃保存测定血肌酐、尿素氮。肾组织在10%甲醛中固定24h,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。常规病理切片,分别行HE、PAS染色,光镜下观察肾组织病理变化,PAS染色切片分析、计算肾小球细胞外基质(ECM)的相对面积。分离各组大鼠肾皮质,肾皮质总RNA提取按Trizol说明书进行。5μg总RNA按逆转录试剂盒说明合成cDNA,以此为模板分别用β-actin、TGF-β1、Smad4引物经PCR方法