2型糖尿病地鼠模型的建立及稳定性研究

2型糖尿病地鼠模型的建立及稳定性研究

2型糖尿病的病因和机制尚不清楚，治疗效果也不完整。因此，建立符合2型糖尿病发病特点的简单组合数据模型对研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前普遍应用高能量高脂饮食和小剂量STZ制备2型糖尿病动物模型,但高能量高脂饮食饲喂方式和时间、STZ的给药方式和剂量,稳定成模时间,模型的稳定性尚无权威性报道。我们结合以往的研究建立制备2型糖尿病中国地鼠模型的方法并系统观察糖尿病地鼠模型的成模率、稳定成模时间和模型的稳定性及影响因素。1材料和方法1.1实验动物与试剂清洁级中国地鼠60只,血糖(4.7±0.47)mmol/L,雌雄各半,约26周龄,体重(127±20.16)g,购自四川省医学科学院实验动物研究所,许可证号:SCXK(川)2004-16。单笼饲养,自由摄食摄水。诱导剂STZ购自Sigma公司。应用稳豪血糖仪监测血糖。鼠胰岛素ELISA试剂盒购自Linco公司。血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFAs)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、总胆固醇(TC)试剂盒购自Randox公司。应用日立8060全自动生化分析仪进行检测。1.2脂饮食阶段a、c组参照中外学者的造模方法并加以改良。现简述如下:健康地鼠60只,雌雄各半,将雄、雌性地鼠随机分为两类,共4组:A、B组为雄性鼠和C、D组为雌性鼠,每组15只。A、C组为实验组,饲以高能量高脂饮食(饲料中含10%的猪油、10%的蛋黄粉、1%的胆固醇和0.02%的胆酸)。B、D组为对照组,饲以普通饲料。在第30天末,实验组(A、C组)禁食12h后,按40mg/kg(将STZ用0.1mmol/L,pH4.2的无菌柠檬酸缓冲液配制成1%STZ溶液,0.2mm微孔过滤灭菌)的剂量间隔2d两次腹腔注射STZ,注射后继续禁食12h。对照组(B、D组):腹腔注射0.1mmol/L,pH4.2的无菌柠檬酸缓冲液(注射方式和剂量同A、C组)。注射完毕后,实验组(A、C组)继续饲以高能量高脂饲料,对照组(B、D组)继续饲以普通饲料。1.3观察指标1.3.1大鼠胰岛素抵抗的评价STZ给药前,测定实验组和对照组地鼠的体重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹血胰岛素(FNS)及血脂水平,以评价饮食诱导胰岛素抵抗的状况。1.3.2血糖和血脂敏感指标注射STZ后12h、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、18d监测空腹血糖和餐后血糖,此后,每周测一次空腹血糖、餐后血糖、体重、血脂、血清胰岛素,观察至第14周共22次。注射STZ3周后,同时满足下列三项标准(①胰岛素敏感指数ISI=[1/(空腹血糖值×空腹血清胰岛素值)]降低;②葡萄糖耐量实验曲线下面积≥26;③72h后空腹血糖≥7.8mmol/L)为2型糖尿病模型地鼠,并判断成模率。1.3.3眼内瞳取血糖检测地鼠禁食12h后,给予葡萄糖2g/kg灌胃,然后在设定的时间点(0、0.5、1、2h)眼内眦取血测血糖,STZ给药第3周和试验最后一天各检测一次。糖耐量曲线下面积=0.5×空腹血糖+30min血糖+1.5×60min血糖+120min血糖。1.3.4病理样品的采集和生产第14周实验结束时分离胰腺,10%中性甲醛溶液固定,逐级脱水,石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察。1.4监测点血糖、血脂及胰岛素值的测定数据以均数±标准差表示,应用软件SPSS13.0,对各监测点血糖、血脂及胰岛素值等进行实验组和对照组的t检验,P<0.05为差异有显著性。2结果2.1各组大鼠血浆tg、tc、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ldl-c、ldl-c、ldl-c、fa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl-c、ffa、ldl实验组和对照组相比体重增加,但无显著性差异。实验组地鼠血浆TG、TC、FFA、LDL-c明显增加,空腹血糖虽有所增高但无显著性差异。实验组地鼠空腹胰岛素明显增加(表1)。2.2血糖、血糖和糖耐量实验组地鼠注射STZ后12h起空腹血糖开始升高,同时出现多饮、多尿等症状。A、C两组各有2只死亡和2只模型未成立,符合成模标准的地鼠数量为22只,成模率为73.3%。实验过程中实验组地鼠症状逐渐明显,但体重无明显变化。实验组地鼠血浆TG、TC、FFA、LDL-c明显增高,而胰岛素虽有所增高但无显著性差异(表2)。自注射STZ48h起,至其后各监测点实验组和对照组的空腹血糖均有明显差异。实验组血糖48h后呈升高状态,C组自第6天起至第14周期间各检测点之间血糖无差异;A组血糖有波动,自第14天起至第14周期间各检测点之间血糖无差异(表3,图1),血糖达到稳定。实验组糖耐量实验各点血糖值、糖耐量曲线下面积显著高于对照组,而ISI显著低于对照组(表4)。胰腺组织形态观察(第14周时):实验组胰岛及岛内细胞数减少,可见胰岛内细胞空泡变性,但未见淋巴细胞浸润(图2,3见封Ⅲ)。3型糖尿病模型糖尿病是严重威胁人类健康的世界性疾病,其中大部分为2型糖尿病,因此2型糖尿病动物模型的研制对研究2型糖尿病的发病机理及治疗具有重要意义。目前常用注射STZ的方法制备2型糖尿病动物模型。结合相关文献,我们采用高能量高脂饮食诱发地鼠胰岛素抵抗,在此基础上通过小剂量STZ腹腔注射形成高血糖状态的方法制造2型糖尿病地鼠模型,同时继续喂以高能量高脂饮食维持2型糖尿病状态。结果显示,此造模方法成模稳定,成模率较高,死亡率低。实验过程中,实验组地鼠经高能量高脂饮食喂养1个月后体重有所增加,血TG、FFAs、TC、LDL-C明显增高,血浆胰岛素明显增加,表明高能量高脂饮食诱导出了胰岛素抵抗。在注射STZ后逐渐出现多饮、多食及多尿等糖尿病表现。模型鼠血胰岛素有所升高,胰岛素敏感指数降低,血糖升高,糖耐量实验异常。同时体内脂代谢异常,血清TG、TC、FFAs和LDL-C明显升高,本模型制备过程模拟了2型糖尿病的发病过程,具有大部分2型糖尿病的临床特点。同时发现,制备的2型糖尿病模型鼠中,血糖稳定性与性别有关,雌鼠血糖于