LC-TOFMS在药物成分分析上的应用

摘要引言液相色谱可将混合物进行很好的分离，而质谱可以给出每一个组分的质核比。如此看来二者的结合具有相当广泛的应用前景，自液相色谱与质谱的接口技术逐渐发展，液质联用技术日益成熟完善。并且已经应用到多种领域的研究方向上。而且中药中还含有许多没有活性甚至有毒的成分，如果只对中药中几种少数的已知成分进行分析和鉴定便不能体现其整体性。如中药狼毒主治水肿，淋巴结、皮肤、骨、副睾等结核等，而且在抗菌、抗病毒、抗结核、抗肿瘤以及免疫等方面表现较好的药理活性。但其同时也表现出对皮肤、口腔及胃肠道黏膜强烈的刺激性和致炎、促发致癌的毒性作用。这些毒性严重制约其临床的用药安全，也为开发低毒高效的药物，中药的开发创新带来了困难。因此对中药成分进行分离和鉴定便显得尤为重要。而液相色谱质谱联用技术以其高分辨率，高灵敏度和专属性已经广泛应用到中药成分分析，且不需要对样品进行复杂的前处理工作，已成为对药物微量杂质、药物降解产物、药物生物转化产物的分析鉴定、体内药物及代谢产物的药物动力学研究、组合化学，高通量分析和天然产物的化学筛选等在内的药代动力学研究领域最强有力的分析工具之一。本实验采用液相色谱-飞行时间质谱联用技术，对中药的组成成分进行分离和鉴定，，通过获得精确分子量（鉴定出的未知化合物的分子量误差小于5ppm），由元素组成推断出未知峰的分子式，大大提高了化合物鉴定的准确率;以便确定其中的活性成分。对后续有效活性成分的提纯，不同成分之间的制约关系的研究都有着重要意义。西安交通大学网络教育学院学士学位论文文献综述液质联用技术概述液质联用技术的发展历程液相色谱法（LC）起源于十九世纪初，是色谱法的一个很重要的组成部分，到了二十世纪六十年代末以其高速分离的性能形成了高效液相色谱法（HPLC）。有机质谱法也是起源于十九世纪初的质谱法（MS），于五十年代初以每个化合物拥有各自不同的特征谱图而著称。HPLC和MS都经历了半个多世纪的发展，作为很成熟的技术为广大分析工作者所接受。高效液相色谱法可以将混合物分好的分离开来，但是不能确定成分；质谱法具有高灵敏度，强特异性，大信息量的鉴定特点，但要求样品有足够的纯度。因此二者的结合是非常理想的。然而存在的问题就是如何把这两种分别具有强大的分离或鉴定功能的仪器，通过相联形成一种在线的优势，对有机化合物进行实时分析。显然，接口就成为这两种技术的汇合点。自1968年发表了高效液相色谱和质谱在线连用接口的实验报告，至二十世纪九十年代初才形成五种联用接口类型的商品仪器，这期间将近二十多年的历史。而GC和MS通过五年左右基本实现联用技术，液质联用的研究历程是很艰巨的。其主要原因是两个方面，分别为真空和样品。高效液相色谱的流出液是流动相的溶剂，而质谱的实验条件是高真空系统，且正常的情况是在气相中实现样品的离子化。要想对流动相中的化学成分进行鉴定，则第一要解决大量溶剂的问题。这两种技术似乎是根本不可能融合的，这就构成了难度。典型的HPLC流量为1mL/min,如果以乙腈计算的话，相当于540mL大气压气体/min,质谱仪的真空系统抽速若为1000L/s，要维持质谱离子源的真空为~mmHg,则HPLC流量只能达到0.01~0.02mL/min。即使加上抽速达6000L/s的低温泵，流量最多达0.1mL/min。这就意味着只能允许不到千分之一的流出液进入质谱仪。倘使在化学电离的操作条件下，也最多允许百分之一的流出液以维持mmHg的离子源真空。其次，和气相色谱对比，高效液相色谱的检测成分大部分是大极性的、挥发度差、不能在高温下保持稳定的一类样品，尤其适合生物样品，和蛋白质等大分子分析。这些功能是气相色谱无法做到的。据已有的化合物分析可知，适合于GC/MS的仅有百分之二十。在二十世纪七十年代质谱的电离方式主要是电子电离（EI）和化学电离（ＣＩ），因为需要汽化，它们要求样品具有良好的热稳定性和易挥发性，这一类的离子化方法对适合液相色谱的样品却有着很大的制约。许多研究者试图用离线的方法将二者连接起来，将液相色谱的流出液收集浓缩蒸干，再打进质谱。但这种方法并不适合推广乃至长期使用，因为它不仅耗费人工和时间，还存在着样品的损失和二次污染的危险，定量也有困难。因此为了实现液相色谱和质谱的实时联用，接口的研究是其中最重要的一环，从这个意义上讲，液质联用的发展史也就是液质联用的接口发展史。在LC/MS的接口研究过程中，曾经出现了二十五种联用接口，而真正进入实用阶段的并形成商品化的只有五种，即传送带，粒子束，连续流快原子轰击，热喷雾和大气压电离。大气压电离包括电喷雾（ESI），大气压化学电离（APCI）和大气压光电离（APPI）以及后来发展的解吸大气压电离（DESI）。电喷雾接口（ESI)的出现翻开了LC/MS联用研究新的一页，成为LC/MS联用发展史上一个重要的里程碑。它改变了质谱技术的发展和应用，成为当前十分热门的检测技术之一。HPLC/ESI一MS技术特别适合于液相色谱的大溶剂量的样品，解决了难度较大的一大批样品的分离和鉴定。尤其是为生物大分子的分析和鉴定提供了一条高效实用的途径，使液质联用技术成为医学生物学等领域不可或缺的检测手段。当然，API技术还在进一步改进、组合和发展以满足分析的各种要求。例如，APPI电离方式的出现就是对ESI乃至APCI不适用于极性小的甚至非极性的化合物的改进。液质联用仪的分类按质谱的质量分析器可将液质联用仪分为单聚焦质谱仪,双聚焦质谱仪,四极杆质谱仪,飞行时间质谱仪,离子阱质谱仪,傅里叶变换质谱仪等。按离子源可分为电喷雾离子化(ESI)，大气压化学电离(APCI)，大气压光电离(APPI)，以及基质辅助光解吸离子化（MALDI）。其中，电喷雾技术在质谱界是目前的热门话题。其出现可以追溯到Iribame等人提出的离子蒸发术语。在sciex的TAGAAPI/MS仪器上进行了测试，1983年制造了样本机器，但未能达到实际阶段。1986年，Bruins等在康奈尔大学改进，在灵敏度方面取得突破，称为离子喷雾技术1985年，首先报道了大气压电喷雾/质谱系统，并从1988年到1989年通过电喷雾法分析了肽，蛋白质和寡核苷酸的生物大分子，其中得到分子量为76000的蛋白，新时代的液质联用接口技为应用质谱奠定了基础，Fenn也获得了2002年诺贝尔化学奖。历史的回顾可见，电喷雾离子化的方法的出现是液质联用技术发展的里程碑。LC/MS在药物领域的应用要确保人民用药的安全，就要严格控制药物的质量，也要全面了解药物的成分组成。许多分析技术和方法在这一领域发挥着重要作用。LC/MS技术实际上是把质谱法作为检测色谱技术鉴定的手段，药物色谱分析中不同方法的比例在1990年为高效液相占约85％，气质联用占12％，液质联用占3％;2000年液相色谱约15％，气质联用为5％，液质联用为80％。目前，新药开发是液相色谱/质谱联用技术发展的主要推动力，使得LC/MS的发展跃上一个新的台阶。液质联用技术中液相色谱的高分离能力，质谱高灵敏度，高特异性已成为药物中痕量杂质的分析鉴定，药物降解产物鉴定，药物生物转化产物鉴定，体内药物以及代谢物，组合化学，高通量分析和天然产物化学筛选的药代动力学研究中最重要的检测方式。现代药学研究领域最强大的分析工具之一是每种技术都有自己的优缺点，（1）由于电离方式不同，对一些化学成分的响应差，不能对现有的所有化合物的结构类型进行检测分析;（2）色谱流动相的使用有限制，严禁使用非挥发性缓冲盐，挥发性缓冲盐的浓度也应控制在10mM以下，这也在某种意义上降低了液质联用的应用;（3）不能提供立体化学结构信息，特别是具有许多同分异构体的天然产物，结构组成等缺乏证据不不能鉴定。但可与核磁检测技术相结合使用。随着科学技术的不断进步，LC/MS技术也在不断发展和创新，扩大液质联用的应用范围，提高对结构信息的检测能力。近年来，随着质谱技术和界面技术的应用突破，LC/MS在药物及其代谢物中的定性和定量研究发挥了极其重要的作用。在药物及其代谢物的定性研究中，LC/MS系统中通常使用的质谱法包括串联四极杆，离子阱，四极飞行时间质谱（Q-TOF）等。所有这些质谱的特征在于离子阱能够进行化合物的多级裂解（达10个水平），因此在确定药物代谢物的结构方面是显着的;Q-TOF将四极杆质谱与高灵敏度和飞行时间高分辨率质谱联用，不仅可用于研究体内小分子代谢，蛋白质，多糖，肽等生物大分子的代谢定性研究也占用其他质谱不能取代的状态。目前，LC/MS使用不同的质谱性能特征，结合同位素标记等技术，在分离药物代谢物鉴定，体内代谢途径等方面对其他技术的分析起了替代作用。对于药物的定量研究，串联四极杆质谱法利用其多级离子选择的特殊性质。在MRM扫描模式下，可以大大提高分析方法的特异性或消除样品，同时保持质谱的高灵敏度在没有材料干扰的情况下，使许多以前不可能的痕量分析和鉴定成为可能。并简化生物样品的制备和分离，大大加快了样品分析速度，特别是对于药物筛选的高速度和临床试验的生物样品的测定。由于串联四极杆质谱在药物定量分析中的优越性能，它在一定范围内是LC-MS/MS的同义词。中药成分研究概述中药狼毒成分研究概述目前，主要采取紫外法，色谱法，色谱-质谱联用法对中药狼毒中含有的主要成分进行了研究。月腺大戟主要含有以下几类物质：萜类，苯乙酮类，黄酮类，单宁类，固醇类，一些挥发油成分和其他成分。1998年，王文祥等对月腺大戟中的萜类物质进行了研究，通过柱色谱的方法分离得到了四种萜类物质，发现并命名了月腺大戟甲素和月腺大戟乙素。二者均为二萜类内酯成分，许多植物中的天然抗肿瘤成分都是该结构。1999年，王文祥等利用硅胶柱色谱分离对月腺大戟的根中的乙酰间苯三酚类衍生物进行了分离和定性，发现了两种新物质3,3′-二乙酰基-4,4′-二甲氧基-2,2′,6,6′-四羟基二苯甲烷-6′-O-β-D-葡糖苷和2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基苯乙酮-4-O-β-D-木糖基(1※6)-O-β-D-葡糖苷。分别将其命名为月腺大戟苷B和月腺大戟苷C。1992年，芮和恺等使用气相色谱-质谱联用的方法对月腺大戟中的挥发油成分进行了分离和定性，精油的收率为0.03%。2006年，粟晓黎等对中药狼毒大戟和月腺大戟采用显微镜法，化学法，液相色谱法，液相色谱-串联质谱法建立了质量标准。这个方法可以可以对狼毒类植物进行常规的监测和鉴别。2014年，孙增玉等使用反复硅胶柱和凝胶柱层析对中药狼毒大戟进行分离和纯化，并对分离出的物质进行了表征，得到了七个化合物。2014年，李青松等采用冷浸提取方法，经分步萃取，利用硅胶柱色谱柱层析和重结晶等方法对中药狼毒大戟进行分离和纯化，并对得到的物质进行了鉴定，首次从中药狼毒大戟中分离得到东莨菪苷、二十四烷酸、丁香酸和蔗糖。TOFMS在药物分析上的应用概述TOFMS即飞行时间质谱，它是所有类型的质谱仪中具有非常广的质量检测范围，较快的分析速度和响应速度，高离子传送率和高灵敏度的一类质谱仪器。目前，TOFMS技术被应用到各个领域，可配合ESI离子源，APCI离子源或MALDI，具有十分广阔的发展前景。近年来，质谱技术飞速发展，已然成为药物成分分析中的一类重要手段。而飞行时间质谱相比于其他质谱来说，有着高分辨能力能得到检测物质的精确分子质量。配合色谱技术或串联质谱技术，使其在药物成分分析的定性定量，中药的质量标准控制，药物代谢过程和代谢产物，新药的开发和研究等方面有着不可或缺的作用。西安交通大学网络教育学院学士学位论文狼毒大戟的液质联用分析中药狼毒指的是草本植物狼毒大戟和月腺大戟的根，两种植物均属于大戟科。有破积杀虫，除湿止痒之功效。一般用来治疗结核病和肿瘤，同时其具有很大的毒性。狼毒大戟的化学组成成分十分复杂，主要有二萜类，固醇类，丹宁类和黄酮类物质。据研究发现狼毒大戟中较丰富的二萜类物质有着较好的抗肿瘤效果。这一方面有待进一步研究，开发天然抗癌药物。狼毒大戟中的主要成分如表2.1所示：表2.1狼毒大戟主要成分序号名称分子式结构式1岩大戟内酯AC19H24O32岩大戟内酯BC19H24O43伪岩大戟内酯AC19H24O3序号名称分子式结构式4伪岩大戟内酯BC19H24O45狼毒甲素C19H24O4617-羟-岩大戟内酯BC19H24O5717-乙酰氧基岩大戟内酯AC21H26O5序号名称分子式结构式8狼毒乙素C27H38O89enti-11b-hydroxyabieta-8(14),13(15)-dien-16-12b-olideC19H26O310langduinBC19H26O311langduinCC40H50O10序号名称分子式结构式12langduinAC20H28O513fischeriaAC18H26O31412-deoxyphorbol-13-hexade-CanoateC36H58O615ProstratinC22H30O6序号名称分子式结构式16cat-16a,17-dihydroxyatisan-3-oneC21H34O317β-amyrinacetateC32H52O2183,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2’6,6'-四羟基二苯基甲烷C19H20O819ebracteolatacpdBC10H12O4现有的研究主要是对狼毒大戟中的一种或几种成分进行定性或定量分析，本实验希望建立一个液相色谱-飞行时间质谱联用的检测方法，对其中的大多数成分进行定性分析。为其不同药效以及毒性的机理研究做基础。仪器与试剂美国安捷伦公司的安捷伦1200系列高效液相色谱仪和安捷伦G6224A飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源（ESI）和大气压力化学离子源（APCI），Masshunter工作站及AnalystQS质谱分析软件,KQ2200DE型数控超声波清洗器，赛多利斯电子天平，乙腈，甲醇等有机溶剂购自美国Fisher公司，水为超纯水。检测条件样品处理取狼毒大戟粉末1g于50ml锥形瓶中，加入80%乙醇10ml。放入温度为30℃的水浴超声中超声一小时。取出摇匀静置，取上清液用0.22um的微孔过滤水膜过滤，得到待测样品。液相色谱检测条件液相条件：色谱柱为WelchUltimateXB-C18（2.1mm*100mm，5um）,柱温为30摄氏度，紫外检测波长为226nm,柱后平衡时间为10min,流速为0.2ml/min,进样量为20ul。表2.2流动相梯度时间（min）水(%)乙腈(%)流速(ml/min)09550.21565350.22535650.23530700.2455950.2905950.2质谱条件质谱从三分钟时开始切入，质谱分析参数：采用ESI源，正离子/负离子模式，毛细管电压4000V，雾化气压力40psi，干燥气流速9L•min-1，干燥气温度350℃，碎片电压160V；参比离子m/z121.050873和922.009798；质量数扫描范围50～2000。结果与讨论液相色谱条件优化参考文献中大多以乙腈-水体系作为流动相，因此设置的初始洗脱梯度如表2.2所示。液相条件：色谱柱为WelchUltimateXB-C18（2.1mm*100mm，5um）,柱温为30摄氏度，紫外检测波长设置三个通道分别为210nm，226nm和290nm,柱后平衡时间为10min,流速为0.2ml/min,进样量为20ul。由得到的液相色谱图2.1可知前10分钟色谱峰未能有效分离，所以微调色谱条件，延长了洗脱时间，增加各色谱峰的分离度，因此将洗脱梯度进行改进如表2.3所示。表2.3优化后流动相梯度时间（min）水(%)乙腈(%)流速(ml/min)09550.21565350.22535650.23530700.2455950.2905950.2图2.1改进前的液相色谱图图2.2改进后的液相色谱图可见在该梯度下各个化合物的分离度较好且可以充分地被洗脱出来。同时查看三个紫外吸收波长下的紫外光谱，发现样品中的大多数成分在226nm下有着较强的紫外吸收。因此将紫外检测波长设为226nm。对不同型号、颗粒直径，不同内径、长度的色谱柱进行实验，考察其对样品中不同成分的分离效果的影响，洗脱梯度，流速及进样量等条件使用优化后的相同的色谱条件。不同色谱柱的型号如表2.4所示。不同色谱柱的检测结果如图2.3、2.4、2.5、2.6和2.7所示。表2.4色谱柱的型号序号型号柱长度（mm）柱内径(mm)颗粒直径(um)流速(ml/min)进样量(uL)1WelchUltimateXB-C181002.150.2202ZORBAXEclipseXDB-C181504.65203ZORBAXRRHDEclipsePlusC181003.01.8204ThermoHypersilGOLD1502.15205ZORBAXEclipseXDB-CN1504.6520图2.3WelchUltimateXB-C18色谱柱狼毒大戟样品总离子流图图2.4ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱狼毒大戟样品总离子流图图2.5ZORBAXRRHDEclipsePlusC18色谱柱狼毒大戟样品总离子流图图2.6ThermoHypersilGOLD色谱柱狼毒大戟样品总离子流图ZORBAXRRHDEclipsePlusC18该色谱柱其颗粒填料小于普通HPLC柱，其柱效显著高于普通5，3μm粒径色谱柱，色谱峰更窄从而灵敏度更高，分析时间缩短，可以达到最好的分离效果。狼毒大戟样品适合用C18柱进行分离，不适合用氰基柱。在C18柱中，填料颗粒直径最小的色谱柱柱效最高，分离度最好。在采集时间为六十分钟以后，由于乙腈的比例很高，离子化效率很低，色谱峰的相应较弱，所以没有明显的峰。选取ZORBAXRRHDEclipsePlusC18色谱柱得到的质谱图进行化学成分定性分析。图2.7ZORBAXEclipseXDB-CN色谱柱狼毒大戟样品总离子流图质谱条件优化由得到的质谱总离子流图可知，在前三分钟所出的物质是一些保留时间短，无法被色谱柱中固定相吸附的表面活性剂。其紫外吸收强度又较大，因此选择质谱切入时间为三分钟，对狼毒大戟中其他成分的检测没有影响。由于狼毒大戟样品中的成分结构种类较多，有在正模式或负模式下的响应各有强弱，因此正模式负模式都做检测。已知物质鉴定选取最优条件下得到的质谱图，在图中对狼毒大戟中的已知成分进行提取，提取到的已知成分为17种（见表2.5），加荷方式基本为[M+H]和[M+Na]两种，主要是二萜类内酯和苯乙酮类物质。表2.5狼毒大戟已知成分定性分析序号名称加荷峰理论分子量实测分子量1[M+H]223.0578223.05962[M+H][M+Na]349.2015371.1835349.1998371.18073[M+H][M+Na]365.1964387.1784365.1950387.17724[M+Na]373.1991373.20165[M+H]197.0814197.0807表2.5续序号名称加荷峰理论分子量实测分子量6[M+H]209.0450209.04427[M+H]193.0501193.04978[M+H][M+Na]497.1295519.1115497.1298519.11189[M+H][M+Na]705.2778727.2598705.2763727.259110[M+Na]427.1733427.1743序号名称加荷峰理论分子量实测分子量11[M+Na]499.1428499.144012[M+H][M+Na]491.1764513.1584491.1755513.156713[M+Na]429.1898429.188514[M+H][M+Na]481.2578503.2398481.2575503.2410序号名称加荷峰理论分子量实测分子量15[M+H]389.1964389.195816[M+Na]575.2498575.248217[M+H]345.1185345.1177未知物质分析从正模式的质谱总离子流图中可得到准确且稳定的26种物质的分子离子峰，其加荷方式有[M+H]，[M+Na]，[2M+H]和[2M+Na]。表2.6质荷比679.5097的匹配结果序号分子式种类m/z分数(MFG)Diff(ppm)DBE1C47H66O3[M+H]679.509785.611.36152C45H64N3O2[M+H]679.509781.413.4115.53C43H62N6O[M+H]679.509774.045.47164C42H66N2O5[M+H]679.509767.717.35115C41H60N9[M+H]679.509765.897.5316.5以序号1的物质为例，在采集时间为24.486min处的质谱图中两个峰的质荷比（m/z）分别为679.5097和701.4915。二者的差值为21.9818，而Na元素与H元素的精确分子质量差值为21.9820。因此基本可以判断，679.5097为该物质的加氢峰，701.4915为该物质的加钠峰。对质荷比为679.5097的峰进行分子式匹配，元素组成为C、H、O、N，匹配结果如表2.6所示。可见序号2和5的匹配结果不饱和度不符合氮规则，1、3、4结果中只有1的ppm在5以内且匹配分数较高。因此基本可推测该物质的分子式为C47H66O3。其他物质的定性分析过程相同，具体物质的定性分析如表2.7所示。图2.8物质1的质谱图表2.7狼毒大戟成分定性分析序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量1C47H66O3[M+H][M+Na]679.5085701.4904679.5097701.49151.361.57678.50122C53H7704N[M+H][M+Na]792.5925814.5745792.5927814.57470.250.24791.58533/[M+H][M+Na]/905.6818927.6645/9044/[M+H][M+Na]/1018.76001040.7428/10175C28H40O11[M+Na]575.2463575.2451-2.09552.25716C22H30O6[M+Na][2M+H][2M+Na]413.1935781.4158803.3977413.1941781.4166803.39971.451.022.49390.20427C25H37NO6[M+H]448.2694448.2684-2.23447.26158C28H44N2O14[M+H]633.2865633.28670.32632.27939C15H19N4O[M+Na]294.1451294.1444-2.38271.1559表2.7续序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量10/[M+H][M+Na]//311.1644333.1465//31011/[M+H][M+Na]//445.2123467.1935//44412/[M+H]/313.2379/31213C22H28N3O5[M+H][M+Na]415.2102437.1921415.2095437.1915-1.68-1.37414.202314C21H35O9[M+H]432.2354432.23611.62431.227615C19H28N3O4[M+H][M+Na]363.2153385.1972363.2145385.1963-2.20-2.34362.207416C20H26O4[M+H]331.1904331.19091.51330.182617C28H25N4O11[M+H]594.1593594.15970.67593.151418C31H58N3O13[M+Na]703.3862703.3851-1.56680.396419C20H26O3[M+H]315.1956315.19600.63314.188220/[M+H][M+Na]//331.2851353.2670//33021/[M+H]/336.2911/33522/[M+H]/304.2995/30323/[M+H]/332.3310/33124C19H40N3O3[M+H][M+Na]359.3142381.2962359.3150381.29762.233.67358.306425C18H39N4[M+H]312.3247312.32593.84311.3169表2.8狼毒大戟成分定性分析（负模式）序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量1/[M-H]/635.0901/6362/[M-H]/633.0748/6343C23H20N4O9[M-H]495.1158495.11651.63496.12364C20H34N16O10[M+COOH]703.2626703.2614-1.35658.26445/[M-H]/181.0530/1826C12H32N6O11[M-H]435.2056435.2047-1.84436.21357C10H28N6O9[M-H]375.1845375.1839-1.30376.19238/[M-H]/339.2358/3409/[M-H]/375.2777/376狼毒大戟样品的负模式效应较弱，加荷方式主要有[M-H]和[M+COOH]两种，除去正模式中已检测到的物质，还检测出9种物质稳定的分子离子峰如表2.8所示。不同提取层的检测分别对狼毒大戟石油醚及乙酸乙酯萃取物（样品1），狼毒大戟正丁醇提取物（样品2）和狼毒大戟水层（样品3）进行液相色谱-飞行时间质谱联用的检测，液相条件和质谱条件均采用前文中优化好的最佳条件。从得到的谱图中可发现，样品中所含有的成分与提取溶剂的极性有关。其结果可以与未经萃取的狼毒大戟样品的谱图相对照。样品经过简单的萃取处理后，可以得到分段的液质联用结果，既减少了分离时间，又能有针对性的对想要的组分进行下一步的研究。小结本章采用实验对大戟科植物狼毒进行了液质联用检测以分析器含有的不同化学成分，对液相色谱的紫外检测波长，流动相洗脱梯度，液相色谱柱进行了优化，对质谱的切入时间和检测模式也进行了试验。最终采取优化好的最佳条件对狼毒大戟样品80%乙醇提取液进行检测，利用液相色谱将其成分分离，利用高分辨飞行时间质谱的精确分子质量数据对其中的17种已知化合物进行鉴定确认，同时对34种未知化合物进行匹配定性。研究发现狼毒大戟中含有的主要化学成分为萜类，松香烷内酯型二萜较多其中含量较高的成分有岩大戟内酯A，岩大戟内酯B，17-羟-岩大戟内酯B，狼毒甲素，prostratin等。这些成分很有可能是狼毒大戟具有抗肿瘤和结核能力的药性基础。研究中发现狼毒大戟中也含有少量的乙酰间苯三酚类成分，如狼毒乙素。此外狼毒大戟中还有许多未知的成分，部分组成的含量还很高，这可能与其毒性和不同的疗效相关。组成成分之间的相互作用和相互制约还有待于进一步的研究。该方法不需要对样品进行分离和提纯，前处理十分简单。而且可以直接检出药品中的几种主要组成成分，对药品的分离提纯，药品主要成分的检测和药品质量的控制都有着很重要的意义。西安交通大学网络教育学院学士学位论文月腺大戟的液质联用分析月腺大戟虽然和狼毒大戟同属大戟科草本植物，但是二者的组成成分却有不同。月腺大戟主要含狼毒甲、狼毒乙素、24-次甲基-环木菠萝烷醇、γ-大戟甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等。其对小鼠的移植性肿瘤有一定的抑制作用，可以在抑制肿瘤生长的同时可提高机体免疫力；在试管内对很多种革兰阴性肠内致病菌有抑制作用。除此之外还有杀虫、抗惊厥等作用。月腺大戟的主要成分如表3.1所示：表3.1月腺大戟主要成分序号名称分子式结构式1巴卡丁C29H46O42巨大戟醇C20H28O53月腺大戟素BC20H30O2序号名称分子式结构式4ebracteolatacpdCC16H22O95ebracteolatinosideAC19H20O116ebractelatinosideBC25H30O137eractelatinosideCC21H30O13表3.1续序号名称分子式结构式8ebracteolatanolideAC20H28O49ebracteolatanolideBC20H30O5仪器与试剂美国安捷伦公司的安捷伦1200系列高效液相色谱仪和安捷伦G6224A飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源（ESI）和大气压力化学离子源（APCI），Masshunter工作站及AnalystQS质谱分析软件,KQ2200DE型数控超声波清洗器，赛多利斯电子天平，乙腈，甲醇等有机溶剂购自美国Fisher公司，水为超纯水。检测条件样品处理取月腺大戟粉末1g于50ml锥形瓶中，加入80%乙醇10ml。放入温度为30摄氏度的水浴超声中超声一小时。取出摇匀静置，取上清液用0.22um的微孔过滤水膜过滤，得到待测样品。液相色谱条件液相色谱条件为:色谱柱为ZORBAXRRHDEclipsePlusC18（2.1mm*100mm，5um），柱温为30摄氏度，紫外检测波长为226nm，柱后平衡时间为10min,流速为0.2ml/min,进样量为20ul。流动相梯度如表3.2所示：表3.2流动相梯度时间（min）水(%)乙腈(%)流速(ml/min)09550.21565350.22535650.23530700.2455950.2905950.2质谱条件质谱检测条件如下：采用ESI源，正离子/负离子模式，毛细管电压4000V，雾化气压力40psi，干燥气流速9L•min-1，干燥气温度350℃，碎片电压160V；参比离子m/z121.050873和922.009798；质量数扫描范围50～2000。结果与讨论液相色谱条件优化图3.1WelchUltimateXB-C18色谱柱月腺大戟样品总离子流图其他液相条件均采用狼毒大戟样品优化后的条件，由得到的不同的色谱柱测试的质谱总离子流图结果可知，RRHDEclipsePlusC18色谱柱的分离效果最好，色谱峰峰形较好可以定性出更多种化学成分。四种C18的色谱柱分离能力相似，但是氰基柱未能将样品较好地进行分离。部分图中出现倒峰，可能是该种物质响应太弱，比基底的响应还低。五种色谱柱得到的谱图见图3.1，3.2，3.3，3.4和3.5。图3.2ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱月腺大戟样品总离子流图图3.3ZORBAXRRHDEclipsePlusC18色谱柱月腺大戟样品总离子流图图3.4ThermoHypersilGOLD色谱柱月腺大戟样品总离子流图图3.5ZORBAXEclipseXDB-CN色谱柱月腺大戟样品总离子流图质谱条件优化由得到的质谱总离子流图可知，在前三分钟所出的物质是一些保留时间短，无法被色谱柱中固定相吸附的表面活性剂。其紫外吸收强度又较大，因此选择质谱切入时间为三分钟，对月腺大戟中其他成分的检测没有影响。由于月腺大戟样品中的成分结构种类较多，有在正模式或负模式下的响应各有强弱，因此正模式负模式都做检测。已知物质鉴定选取最优条件下得到的质谱图，在图中对狼毒大戟中的已知成分进行提取，提取到的已知成分为10种（见表3.3），加荷方式基本为[M+H]和[M+Na]两种，主要是二萜类内酯和苯乙酮类物质。表3.3月腺大戟已知成分定性分析序号名称加荷峰理论分子量实测分子量1[M+H]315.1960315.19392[M+H]259.2062259.20573[M+H]317.2116317.2119序号名称加荷峰理论分子量实测分子量4[M+H]289.2167289.21605[M+H][M+Na]301.2167323.1987301.2164323.19856[M+H]193.0501193.04937[M+H]359.1342359.13378[M+H]351.2171351.2170表3.3续序号名称加荷峰理论分子量实测分子量9[M+H][M+Na]477.1608499.1428477.1568499.138910[M+H][M+Na]491.1764513.1584491.1759513.1604未知物质分析从正模式的质谱总离子流图中可得到准确且稳定的59种物质的分子离子峰，其加荷方式有[M+H],，[M+Na]，[M+NH4]等。由于月腺大戟样品的正模式响应较好，因此不对负模式进行定性。对未知物质的定性分析方法与狼毒大戟样品相同，具体物质的定性分析如表3.4所示。表3.4月腺大戟成分定性分析序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量1C47H66O3[M+H][M+Na]679.5084701.4904679.5098701.49172.061.85678.50122C53H7704N[M+H][M+Na]792.5925814.5744792.5924814.5728-0.13-1.97791.58533/[M+H][M+Na]/905.6789927.6603/9044/[M+H][M+Na]/1018.76661040.7484/10175C22H31N5O7[M+H]478.2296478.23052.26477.22236C31H49N5O6[M+Na]/658.34280.22/7C31H49NO12[M+H]628.3328628.33310.20627.32498C25H39N5O4[M+Na]496,2894496.28960.23474.30759C20H31NO5[M+H]366.2275366.2272-1.01365.219710C20H24O3[M+H]313.1798313.1791-2.36312.172011C20H26O4[M+H]331.1904331.1899-1.46330.182612C16H12N2O2[M+H]265.0972265.0969-0.90264.089313C14H17NO6[M+H]296.1129296.1123-1.30295.105014C19H33N5O[M+H]348.2758348.2755-1.07347.268015C10H12O4[M+H]197.0808197.0802-3.05196.073616C20H30O2[M+H]303.2319303.2320-0.79302.224017C21H36O5[M+H]369.2636369.26401.10368.256318C21H38O6[M+Na]/469.25671.06/19C20H30O5[M+H]351.2166351.21731.78350.208920C23H25NO7[M+H]428.1704428.17050.05427.160621C37H52N10O4[M+H][M+Na]701.4246723.4065701.4239723.4082-0.121.79700.416822C23H29N5O2[M+H]408.2394408.2393-0.05407.231623C20H28O4[M+H]333.2060333.2057-0.52332.198224C18H32O4[M+H][M+Na]313.2373335.2193313.2376335.21990.832.44312.229525C20H30O5[M+H]351.2166351.21680.81350.208826C20H24N2O6[M+Na]411.1527411.15260.60388.162927C21H29N3O8[M+Na]474.1847474.1844-0.39451.194928C24H34N2O7[M+H]463.2439463.22451.46462.2361表3.4续序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量29C18H28O3[M+Na]315.1931315.19341.23292.203330C21H22N10[M+H]415.2102415.21041.19414.202331C20H30O4[M+H][M+NH4]335.2217352.2482335.2219352.24820.740.00334.213932C19H21NO7[M+H]376.1391376.1388-1.10375.131333C28H45N3O6[M+H]520.3381520.3375-1.04519.330334C30H52N10O8[M+NH4][M+Na]698.4308703.3862698.4316703.38660.620.72680.396435C20H30O2[M+H]303.2319303.23252.04302.224036C17H26N6O3[M+H][M+NH4]363.2139380.2405363.2143380.24101.661.47362.206137C25H40N6O[M+H]441.3336441.33380.02440.325838C42H60O10[M+Na]747.4079747.40790.00724.418139C26H45N3O6[M+H]496.3381496.33841.03495.330340C15H19N[M+H]214.1590214.1587-2.10213.151241C21H35NO2[M+H]334.2741334.2735-1.89333.266242C20H28O3[M+H]317.2111317.21192.41316.203343C40H52O8[M+Na]683.3554683.3544-1.35660.366244C28H28O12[M+H]557.1654557.1653-0.09556.157545C21H32N4[M+H][M+Na]341.2700363.2519341.2698363.2522-0.390.81340.262146C21H22N4[M+H][M+Na]331.1917353.1737331.1920353.17340.850.19330.183947C8H12O4[M+Na]195.0628195.06332.99172.073048C15H18N6[M+H][M+Na]283.1666305.1485283.1676305.14914.122.44282.158749C14H33N7O[M+H]316.2819316.28272.73315.274150C15H16N6O6[M+H]377.1204377.12112.55376.112651C8H24N6O5[M+H]285.1881285.18800.55284.180352C28H44N10O3[M+Na]591.3490591.3483-1.11568.359253C15H24N6[M+H]289.2135289.21433.10288.205754C18H30O[M+Na]285.2189285.21962.65262.229155C22H40O4[M+H][M+Na]369.2999391.2819369.2997391.2820-0.86-0.10368.2921表3.4续序号可能的分子式加荷峰理论分子量实测分子量偏差（ppm）推测分子量56C32H42O7[M+NH4][M+Na]556.3269561.2823556.3265561.2806-0.29-1.84538.292557C23H26N4[M+H][M+NH4]359.2230376.2496359.2235376.24991.571.18358.215258C46H58O8[M+H]739.4204739.4191-0.70738.412659C32H47NO7[M+H]558.3425558.3420-1.13557.3347不同提取层的检测分别对月腺大戟石油醚萃取物（样品1），月腺大戟乙酸乙酯萃取物（样品2），月腺大戟正丁醇萃取物（样品3）和月腺大戟水层（样品4）进行液相色谱-飞行时间质谱联用的检测，液相条件和质谱条件均采用前文中优化好的最佳条件。从得到的谱图中可发现，样品中所含有的成分与提取溶剂的极性有关。其结果可以与未经萃取的月腺大戟样品的谱图相对照。样品经过简单的萃取处理后，可以得到分段的液质联用结果，既减少了分离时间，又能有针对性的对想要的组分进行下一步的研究。小结研究发现月腺大戟中含有的主要化学成分为乙酰间苯三酚类和二萜类，其中含量较高的成分包括ebracteolatacpdB，巨大戟醇，月腺大戟素A，月腺大戟素B等，为月腺大戟的特征化学成分组成。可见月腺大戟的化学成分和狼毒大戟是有明显区别的。可以用于鉴定两种药材。狼毒丙素没有在样品中检出。可能在提取过程中破坏了这个成分或者是在放置过程中导致其化学键断裂。月腺大戟中的成分质谱的响应较狼毒大戟要好，检测到的成分更多。其中有许多极性比较大的小分子，可以进一步研究分离和提纯，检测其药物活性。结论本论文以两种狼毒药材中所含的主要生物活性成分为研究对象，确定了狼毒药材中多种成分提取的最佳方法。利用高效液相色谱对大戟科狼毒中的二萜类及乙酰基间苯三酚衍生物等成分进行了分离分析，确定了最佳的液相分离分析条件；同时结合飞行时间质谱对大戟科狼毒中的化学成分包括狼毒大戟甲素，严大戟内酯A，