免疫学技术与方法

免疫学技术与方法1.指利用抗原抗体反响的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的制备方法。分为：免疫检测技术〔血清学技术〕细胞免疫技术免疫制备技术免疫学技术2.血清学技术的类型〔免疫检测技术〕凝集反响沉淀反响补体结合反响免疫标记技术3.指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。细胞免疫技术淋巴细胞别离与检测淋巴细胞功能测定细胞因子测定体内细胞免疫试验玫瑰花环试验T细胞亚群检测技术淋巴细胞转化试验细胞毒性T细胞试验巨噬细胞移动抑制试验白细胞介素测定干扰素测定皮肤试验4.免疫制备技术抗原制备抗体制备抗体和细胞因子纯化淋巴细胞制备抗体标记与致敏指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。5.体内杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤—超敏反响、免疫性疾病等体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等又称：serologicalreaction血清学实验第一节抗原抗体反响原理及特点6.一、抗原抗体反响的原理根本原理：特异性〔epitopeHVR〕可见性〔凝集、沉淀、溶血等〕结合力(4种)7.高度互补〔epitope-HVR〕紧密接触结合力抗原

抗体带电离子异性相吸静电引力分子极化范德华引力形成氢键氢键引力形成疏水基团疏水作用力作用最小最具特异性作用最大抗原抗体结合可见反响比例适宜8.

结合力的大小

亲和力（affinity）亲合力（avidity）9.一个抗体结合点与一个抗原表位间的结合强度。〔singlepoint－singlepoint)亲和力用平衡常数表示：K=K1/K2亲和力〔affinity〕：即：结合常数/解离常数K值越大，亲和力越高，与抗原的结合越牢固10.亲合力〔avidity〕指整个抗体分子与抗原之间结合的强度

(allpointsallpoints)与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。11.二、抗原抗体反响的特点〔一〕特异性〔specificity〕概念：一种抗原只能与其相应的抗体结合起反响Ag-epitopeHVR-Ab空间结构高度互补意义检测时常用Ag检测未知Ab，或反之。相对性：当抗原之间有相同或相似结构的epitope时（共同抗原）交叉反应（crossreaction）分子根底：12.〔二〕比例性(proportionality)指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗体的浓度比例适当时，才出现可见反响。1929年Heidelberger以固定Ab量逐渐增加Ag量的试验发现带现象。1977年Green把此现象称为钩状效应〔hookeffect〕，包括前后带现象。指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不适宜而致检测结果呈假阴性的现象。13.抗原抗体反响比例性示意图14.1、带现象:在抗原抗体反响等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反响,这种现象称为带现象2、等价带:抗原抗体反响曲线的顶峰局部是抗原抗体分子比例适宜的范围,称为抗原抗体反响的等价带。在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。3、前带现象:抗体量过剩时,不出现可见反响。4、后带现象:抗原量过剩时,不出现可见反响。15.抗体的两个Fab段分别结合两个epitope，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物〔可见〕。网格学说16.Ab/Ag过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物〔不可见〕。17.〔三〕可逆性〔reversibility〕解离1.Ag+AbAg-Ab一定条件（动态平衡）动态平衡公式:

[Ag]+[Ab][Ag-Ab]

K1:结合常数；K2：解离常数K1K218.〔四〕阶段性数秒～数分钟，肉眼不可见数分～数小时肉眼可见两个阶段特异性结合可见反应阶段19.〔一〕电解质作用：中和胶体外表电荷，破坏水化层，使Ag-Ab聚集。常用：0.85%生理盐水，PBS、Ca2+、Mg2+等。盐析〔salting〕即电解质浓度过高引起的非特异性蛋白质沉淀。三、影响抗原抗体反响的因素20.〔二〕酸碱度Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有固定的等电点，pH过高或过低均可影响Ag、Ab反响一般：pH6～8为宜。注意：自凝——即pH到达或接近抗原的pI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。酸凝——pH过低时造成的蛋白质自凝现象。21.〔三〕温度—影响反响速度一般：15～40℃为宜，最适温度：37℃,过高〔>56℃〕:Ag-Ab解离，Ag、Ab变性。22.免疫学检测技术的评价标准Specificity〔特异〕：检测信号针对性和排他性Sensitivity〔灵敏〕：可测出的最低含量Simplicity〔简便〕：操作是否方便Safety〔平安〕：是否有污染，对操作者的伤害Saving〔节约〕：性能/价格比23.免疫检验技术开展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反响〔沉淀反响、凝集反响〕加速的肉眼观察的抗原抗体反响〔电泳技术、别离技术〕标记性免疫技术提高抗原抗体反响的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反响原理结合，加快了反响过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最正确组合24.抗原抗体反响的根本类型表反响类型实验技术检测方法敏感度沉淀反响液相沉淀试验观察沉淀、检测浊度+，++++琼脂凝胶扩散观察扫描沉淀线或环+凝胶电泳技术或峰或弧++补体参与反响补体溶血试验以裸眼或光电比色仪++补体结合试验观察测定溶血现象+++免疫标记技术荧光免疫技术检测荧光现象++++放射免疫技术检测放射性++++酶标免疫技术检测酶底物显色++++发光免疫技术测定发光强度++++生物素-亲合素技术结合其它标记技术++++金标免疫技术检测金颗粒沉淀++++凝集反响直接凝集试验用裸眼、放大镜或显+间接凝集试验微镜观察红细胞或胶++凝集抑制试验乳等颗粒和各种凝集+++协同凝集试验现象+++抗球蛋白试验+++中和反响病毒中和试验病毒感染性丧失+毒素中和试验外毒素毒性丧失++25.一、凝集反响〔Agglutination〕颗粒性抗原〔如细菌、细胞〕与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反响。第二节基于Ag-Ab反响的检测方法26.27.2、凝集反响的用途〔1〕定性检测即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性〔2〕定量检测即将标本作一系列倍比稀释后进行反响，以出现50%凝集的最高稀释度作为滴度。凝集反响方法简便，敏感性高，临床应用广泛。28.3、凝集反响的分类玻片凝集反应试管凝集反应29.〔一〕直接凝集试验〔Directagglutination〕30.1、玻片凝集试验31.2、试管凝集试验32.〔二〕间接凝集试验indirectagglutination33.已知抗原检测抗体已知抗体检测抗原正向反向34.1、正向间接凝集反响35.2、反向间接凝集反响36.3、间接凝集抑制反响37.4、协同凝集反响〔coaggoltination〕38.可溶性抗原〔血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等〕与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反响。二、沉淀反响39.液相沉淀反响凝胶扩散沉淀凝胶免疫电泳絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳火箭电泳对流免疫电泳免疫印迹等40.1、絮状沉淀试验操作步骤：〔1〕将可溶性抗原作一系列倍比稀释。〔2〕各管参加一定浓度的适量抗血清。〔3〕振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。〔4〕产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反响的最适比。〔一〕液相沉淀反响41.2、环状沉淀试验操作步骤：〔1〕用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管〔5×50mm〕底部，防止产生气泡。〔2〕将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。〔3〕置沉淀管于室温下使其反响，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现那么为阴性。应用：主要用于抗原的定性试验。用抗体来检测未知抗原。〔诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定〕。42.3、凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例适宜的扩散部位相遇形成沉淀线的反响。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。最常用的方法为：①单向琼脂扩散试验②双向琼脂扩散试验43.〔1〕单向琼脂扩散试验原理：1％～2%的琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98％-99%的电解质溶液。凝胶网孔较大，允许分子量在200kD以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200kD以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。

44.单向免疫扩散试验示意图环的直径与抗原含量成正相关45.〔2〕双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散时，在两孔间可出现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。46.47.3、免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反响的结合产物。两大优点：一是加快了沉淀反响的速度二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反响，以此作更细微的分析。免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等48.〔1〕血清免疫电泳将抗原混合物在凝胶中用电泳别离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，参加抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。49.50.(2)对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术51.〔3〕火箭免疫电泳火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散开展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。52.是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。经过PAGE别离的蛋白质样品，转移到固相载体〔如NC膜〕上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的第二抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳别离的蛋白成分。广泛应用于检测蛋白的表达。〔4〕免疫印迹westernblot53.kDaM123456907560402554.免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反响。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。四、免疫标记技术55.常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫印迹技术蛋白质芯片技术

56.抗体制备多克隆抗体单克隆抗体标记物与标记方法放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统免疫分析根本环节57.分析方式设计

非竞争方式、竞争方式；

直接法、间接法；

标记抗原、标记抗体；

均相、非均相信号检测

与相应的标记物对应。主要为分光光度法、

荧光光度法、化学发光检测法。58.是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反响，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度〔pg〕和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技术59.放射免疫分析－根本原理竞争性结合反响的经典标记抗原〔Ag*〕和非标记抗原〔Ag〕与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力60.

Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量

测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性

放射免疫测定法(RIA)示意图61.将荧光素〔异硫氰酸荧光素或罗丹明等〕标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2.免疫荧光技术62.免疫荧光技术——直接法AgY荧光素标记的特异性抗体组织切片或细胞63.免疫荧光技术——间接法AgYY荧光素标记的抗抗体组织切片或细胞待测抗体64.免疫荧光染色显示细胞骨架

免疫荧光染色是利用抗原－抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种：显示绿色荧光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：RhodamineB〔罗丹明〕,TexasRed,Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa－350,DAPI用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,人皮肤角化细胞免疫荧光染色65.3、免疫酶技术概念：是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反响。将抗原-抗体反响的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反响判定结果。66.优点：⑴灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。⑵应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位。⑶不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条件，免疫荧光法需要荧光显微镜。⑷酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。67.⑴活性高，分解底物的能力强。⑵特异性强，即作用于底物的专一性强。⑶与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。⑷与底物作用可以显色。⑸纯度高、易纯化。⑹可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。⑺测定方法简单。⑻来源广、价格低。标记酶的选择条件：

68.酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基联苯胺（DAB）

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色360,450

420以HRP最为常用，具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。69.70.酶联免疫吸附试验Enzymelinkedimmunosorbentassay简称：ELISA1971年Engvall和Perlmann发表是一类在固相载体上进行免疫酶染色的免疫酶标记技术71.1〕根本原理与类型一种固相免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体外表，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体外表吸附的抗体或抗原发生反响，后参加酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法别离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后参加酶反响底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。72.ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。有三个必要的试剂：〔1〕固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"〔immunosorbent〕；〔2〕酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"〔conjugate〕；〔3〕酶反响的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。73.①双抗体夹心法测抗原检测抗原最常用的方法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色74.②双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找适宜的标记方法。Ag固相载体酶标抗原75.③间接法测抗体

检测抗体最常用的方法间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。76.用特异性抗体包被固相载体测定孔加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照孔只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量④竞争法77.⑤捕获包被法测IgM抗体IgM的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。抗人IgM抗体连接在固相载体形成固相抗人IgM加底物显色：如有颜色显示，那么表示血清标本中的特异性IgM抗体存在〔阳性反响〕78.⑥ABS-ELISA法〔亲和素-生物素系统-酶联免疫吸附试验〕ABS：亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system〕①：固相支持物；②：样品；③：特异性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG抗体〔Biotin〕；⑤：HRP酶标链亲和素〔Avidin〕；⑥：DAB显色液；⑦：显色；79.亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反响大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法结合起来可分为酶标记亲和素-生物素〔LAB〕法和桥联亲和素-生物素〔ABC〕法两种类型。两者均以生物素标记的抗体〔或抗原〕代替原ELISA系统中的酶标抗体〔抗原〕。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。科研工程中检测微量的成分如细胞因子常用本法。80.2〕ELISA的一般操作方法81.ELISA试剂盒82.83.84.85.86.共同特点：象搭积木一样在固相载体上一层一层叠加87.88.89.90.91.4、免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反响的一种免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在复原剂(如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等)作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。92.胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，具有高电子密度，在电镜中颗粒致密，易于识别，定位比酶反响物精确。93.早孕试纸条：两条杠，检测迅速，灵敏度高94.胶体金快速诊断技术的特点

简捷快速：操作简单，一般只要5-10min就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要时间更长。结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。特异性好：用单克隆抗体标记，具有很好的特异性。95.单个核细胞的别离淋巴细胞亚群的别离T细胞功能检测B细胞功能检测种类免疫细胞及其亚类别离、鉴定和检测淋巴细胞功能测定T细胞的鉴定和检测B细胞的鉴定和检测第三节

检测淋巴细胞及其功能的体外试验96.一、细胞别离原理1、基于细胞的物理特性1〕细胞比重差异2〕细胞的粘附性3〕细胞对渗透压改变的敏感性2、基于细胞外表的特异性标志物1〕免疫磁珠别离法2〕流式细胞术97.3、血液细胞的组成及比重外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.0901.09298.原理：外周血各种血细胞的比重不同，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以别离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。一〕单个核细胞别离密度梯度离心法二、细胞别离方法99.离心后PBMC红细胞粒细胞Ficoll/60%Percoll稀释外周血稀释的血浆、血小板Ficoll/60%Percoll100.二〕淋巴细胞亚群的别离尼龙棉别离法E花环别离法洗淘法流式细胞术混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞被选择性粘附于尼龙毛上，多数T细胞那么通过尼龙毛柱人T细胞与SRBC结合形成E花结，经密度梯度离心，花结形成细胞沉于管底；用低渗裂解花结中的SRBC即获得T细胞。将抗特定标志的抗体包被培养板，参加淋巴细胞悬液，相应的细胞即结合于培养板外表，与悬液中的其他细胞别离。借助流式细胞仪对细胞快速鉴定和分类、并进行多参数定量测定和综合分析的技术。磁珠别离将特异性抗体与磁性微粒交联，与表达相应膜抗原的细胞结合，应用强磁场别离所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选101.流式细胞术概念:流式细胞仪(flowcytometer,FCM)：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(flowcytometry)：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。又称荧光激活细胞分选仪别离法〔FACS〕102.机型1.分析型流式细胞仪：检测标记细胞的百分比含量。同时检测四色不同染色的细胞。2.分选型流式细胞仪：无菌获取阳性细胞，以进一步培养。同时获取四色不同染色的细胞。流式细胞术可以同时鉴别单个细胞上的多种抗原，而且可以在极短时间内分析大量细胞。103.流式细胞仪的工作原理光学系统

激光光源 光收集系统液流系统

流动室液流驱动系统电子系统

光电转换 数据处理系统细胞分选系统104.特点

1、各种组织细胞均可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成单细胞悬液均能分析。2、测量速度快，每分钟能测量数千至数万个细胞。3、可进行多参数的分析，可同时检测四种不同荧光染色的细胞。新一代的流式可同时检测十多色的细胞。4、可将目的细胞无菌分选出来做进一步的培养。105.三、淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反响；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反响、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。106.(一)T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验107.1、T淋巴细胞增殖试验1〕原理：T淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松108.2〕淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHAT细胞ConAT细胞PWMT、B细胞LPSB细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原109.3〕检测方法形态法：刺激物淋巴细胞〔4-6天〕母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞DNA合成期+3H-TdR掺入

收集细胞

检测β射线测定细胞内的3H－TdR110.形态学检查法111.原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将噻唑盐〔MTT〕由黄色转变为蓝紫色的甲臜，甲臜的形成量与细胞增殖程度有关，与活细胞数成正比。甲臜溶于有机溶剂〔DMSO、乙醇等〕后，可在560nm波长下用酶标仪检测。MTT法简单快速、准确，广泛应用于疫苗免疫效果测定、新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。MTT法112.培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度1