日粮添加甘露寡糖对肉仔鸡肠道菌群稳定性及多样性的影响

日粮添加甘露寡糖对肉仔鸡肠道菌群稳定性及多样性的影响

胃是动物体消化的重要场所。维持肠道健康是确保动物身体正常生长的关键。肠道微生物区域的稳定和平衡对确保肠道健康起着重要作用。肠道微生物通过释放某些生物活动物质或间接激活肠道信息系统，影响球孢菌的生长和肠道粘膜的完整性，对整个身体的营养和免疫起着重要作用。随着微生物技术的发展，越来越多的肠道微生物被发现和培育。到目前为止，已经发现了400多种不同大小的微生物。由于实验条件的限制，过去的肠道微生物研究主要通过传统的微生物培养方法来限制肠道微生物区域的真实性。随着16srr多样性方法的发展和应用，人们可以快速、准确地了解肠道微生物区域的变化。甘露寡糖(mannose-oligosaccharides,MOS)又称甘露低聚糖或葡甘露寡聚糖.作为一种新型微生态添加剂,MOS用量少、纯天然、无残留且稳定性强,同时还具有吸附肠道病原菌和发挥免疫调节作用的双重功效,能够提高动物机体抗病能力,从而提高动物的生产性能,被认为是抗生素强有力的潜在替代品.早在1989年就有人证实了日粮中添加MOS能够成功抑制有害菌在肉鸡肠道中的定殖.本试验利用现代分子生物学技术对肉仔鸡生长过程中肠道微生物区系发育进行了较为系统的研究,并重点探讨了日粮中添加MOS对肉仔鸡肠道微生物区系发育的影响,为进一步认识MOS及其推广应用提供一定的理论依据.1材料和方法1.1股份有限公司财务风险1日龄AA肉鸡购至安徽和威农业开发股份有限公司;试验所用美国奥特奇公司生产的甘露寡糖(奥奇素,Bio-MOS)由南京禾嘉牧业有限公司提供.1.2日粮基础饲草料选择体质量基本一致的1日龄健康AA肉仔鸡192羽,随机分为2组:Ⅰ组(对照组:饲喂基础日粮);Ⅱ组(前期:饲喂基础日粮+0.2%Bio-MOS;后期:饲喂基础日粮+0.1%BioMOS).每组96只,4个重复,每个重复24羽.试验期为42d.1.3.2.4饲养管理肉鸡基础日粮组成和营养水平见表1,试验用料为粉料.试验肉鸡饲养于同一鸡舍中,采用层叠笼养,自由采食和饮水,24h光照,免疫程序及其他饲养管理按常规进行.试验地点为南京农业大学动物科技学院动物房.1.4鸡肠段内容物的制备分别于7、14、21、28、35和42日龄每组随机取体质量相近的12只鸡宰杀,剖开腹腔,分别结扎肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠,无菌条件下取肠段内容物,置于冰块上.将同组12只鸡各肠段内容物等量混合均匀,分装,-20℃保存.1.5提取细菌总dna参照Zoetendal等的方法,用珠磨法机械破碎样品,而后再用酚和V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1提取肠道食糜总DNA.1.6pcr扩增条件对细菌16SrDNA的V6-V8区段进行PCR扩增.上游引物为带GC夹子的U968,下游引物为L1401.上述引物均由上海英骏公司合成.PCR扩增条件:94℃预变性4min;94℃变性20s,56℃退火20s,68℃延伸40s,35个循环;最后68℃延伸7min.PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小和浓度,-20℃冰箱保存备用.1.7srrna基因多态性电泳参照Muyzer等的方法,对PCR扩增产物进行DGGE分析.DGGE用8%聚丙烯酰胺凝胶(含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),对16SrRNA基因的V6~V8可变区片段进行电泳,尿素浓度梯度为35%~55%,电泳采用DcodeDGGE系统(Bio-Rad).1.8带的特定序列的测量和分析1.8.1dna提取和纯度将EB染色的DGGE胶片置于紫外灯下,切下不同位置的条带,分别放入1.5mL离心管中,用DNA回收试剂盒进行DNA回收和纯化.1.8.2序列测量1.9pcr-dppe电泳图谱的聚类分析使用QuantityOne(Bio-Rad)分析软件包对PCR-DGGE电泳图谱进行条带计数,用非加权成对算术平均数(unweightedpairgroupmeanaverage,UPGMA)进行聚类分析.2结果与分析2.1不同日龄鸡肠道微生物多样性的变化图1为7、14、21、28、35和42日龄AA肉仔鸡肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物菌群16SrDNAV6-V8区PCR-DGGE图谱.结果表明,肉仔鸡消化道不同部位微生物的组成不尽相同,优势条带大都位于图谱偏下的位置,主要为Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)、Lactobacillusjohnsonii(约汉逊氏乳酸杆菌)、Lactobacilluscrispatus(卷曲乳酸杆菌)和Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌)(表2).随着日龄变化,各消化道中的一些优势条带也随之改变.7日龄时,Coprococcuscomes(陪伴粪球菌)和Ruminococcuslactaris(酸奶瘤胃球菌)同为十二指肠中的优势菌,盲肠中细菌的优势性不明显.14日龄时,Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌)开始在盲肠中占优势地位.28日龄时,回肠中出现了新的优势菌———Clostridiumbartlettii(梭菌属),但至35日龄消失.42日龄时,十二指肠中检测出2株新的菌株,即Clostridiumbartlettii(梭菌属)和Ruminococcusgnavus(活泼瘤胃球菌),而盲肠的优势菌则变为Ruminococcusobeum(卵瘤胃球菌)和Carnobacteriumsp.(肉杆菌属),各消化道微生物区系基本成形.对于PCR-DGGE方法来说,图谱的条带数反映了整个菌群的多样性.图2结果表明,盲肠内微生物种类在不同日龄肉鸡中表现最为丰富,其次是回肠、空肠,肌胃和十二指肠中细菌种类相对较少.1~21日龄时,肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物中微生物的多样性随日龄的增加而呈上升趋势,盲肠中的条带数最多;而28日龄时,各消化道部位的多样性均较21日龄有所下降;试验后期,十二指肠和回肠的微生物多样性仍随日龄上升,肌胃和空肠的微生物多样性在35日龄时出现峰值,盲肠则是在35日龄时出现了低谷,28、42日龄都较其丰富.对DGGE电泳结果进行UPGMA相似性聚类分析的结果(图3)表明:各日龄泳道之间带谱相似性较差,其中盲肠各日龄间的相似性最高只达到63%,最低只有18%;肌胃中带谱相似性普遍高于其他消化道,最高也只达到了77%.这也表明,消化道越接近远端,各日龄间微生物区系的相似性就越低.2.2不同菌株在肌胃中的菌群变化图1、图2结果表明,饲喂MOS后,肉仔鸡各日龄段、各消化道的微生物区系出现了不同的变化,主要集中在生长前期,并且各消化道微生物群落的丰度并没受太大影响,肌胃中的微生物区系基本没有变化.7日龄时,MOS促进了空肠中Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)的生长,抑制了回肠中Streptococcussuis(猪链球菌)的生长,同时还促进了盲肠中Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌)的生长.14日龄时,对照组十二指肠中Lactobacillusjohnsonii(约汉逊氏乳酸杆菌)和Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)都是优势菌群,而MOS组只有Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)1种优势菌群;空肠、回肠和盲肠的菌群没有明显变化.28日龄时,MOS组各肠道的优势菌群没有改变,但MOS消除了空肠中的Ruminococcussp.(瘤胃球菌属),并增加了回肠中Streptococcussuis(猪链球菌)和盲肠中Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌)的数量.35日龄时,十二指肠、空肠和回肠的菌群没有明显变化,但MOS减少了盲肠中Ruminococcusobeum(卵瘤胃球菌)和Carnobacteriumsp.(肉杆菌属)的数量.42日龄时,MOS削弱了Clostridiumbartlettii(梭菌属)和Ruminococcusgnavus(活泼瘤胃球菌)这2种菌在十二指肠以及空肠中Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)的优势性;同时MOS增加了Clostridiumbartlettii(梭菌属)在回肠中的数量,取代了Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)的优势性;对于盲肠的菌群结构,MOS没有明显变化.图3结果表明,空白组各日龄间肌胃中菌群相似性最高达77%,十二指肠最高为68%,空肠最高为72%,回肠最高为49%,盲肠最高为63%;MOS组与空白组相比较,肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠中相似性最高分别达76%、84%、72%、49%和63%.这说明,日粮中添加MOS会对肉鸡的肠道菌群产生影响,但是日龄的变化仍是影响肠道微生物区系的主要因素.3肠道微生物的模拟大量研究表明,不同个体之间肠道菌群存在很大差异.即使处于同一饲养环境中,日龄和日粮均相同,对肠道微生物带谱的检测都会有所不同.为了能够反映各处理间肠道微生物的真实情况,样本大小(鸡只的数量)非常关键.Zhou等利用PCR-DGGE技术研究了分别混合2~15只鸡肠道样品后图谱的差异性,发现当对5个以上的个体样本进行混合时,PCR-DGGE图谱有很大的相似性,能够代表整体的菌群组成.为了减小个体之间差异对试验结果的影响,本试验中,各组取12只鸡分别将其肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物混合后提取细菌总DNA,可保证结果不受个体差异的影响,具有代表性.3.1微生物的来源由于家禽消化道不同部位的生理环境不同,使得各部分间微生物区系存在一定特异性.vanderWielen等研究表明,肉鸡嗉囊、十二指肠、远端回肠和盲肠中微生物区系的多样性随着日龄的增长而增加.同时Knarreborg等还表明,肉鸡回肠中微生物区系的组成随着日龄的变化而变化.本试验结果表明,从整体趋势上来看,随着日龄的变化,各消化道的微生物区系也由简单向复杂发展.并且不同消化道之间的菌群多样性存在一定差异,盲肠中微生物的多样性在不同日龄肉鸡中表现最为丰富,这与Zhu等的研究结果相似.其次是回肠、空肠,肌胃和十二指肠中细菌种类相对较少.肌胃内的微生物主要来源于饲料,细菌的种类和数量较低;十二指肠内的环境不利于细菌生长,所以DGGE图谱较简单.这与传统培养方法的检测结果相似,vanderWielen等和Gong等也有类似报道.对肉仔鸡各消化道PCR-DGGE图谱特异性和共性条带的测序结果进一步证明了消化道不同部位对菌群组成的影响.传统培养方法已经证实肉仔鸡肠道内优势菌群的数量会随年龄增长而增加.消化道前段的优势菌群主要是乳酸杆菌类,活菌含量在1×107cfug-1左右,主要由1~3种乳酸杆菌组成.本试验中,肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠各日龄段的优势菌群主要为Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)、Lactobacillusjohnsonii(约汉逊氏乳酸杆菌)、Lactobacilluscrispatus(卷曲乳酸杆菌)和Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌),与上述报道相符.同时在这些消化道部位还分别检测到其他菌种的定殖,也说明传统的培养技术存在很大的局限性,不能真实还原整个肠道微生态环境.Amit-Romach等分别对肉仔鸡4、14、25日龄的肠道菌群进行检测后发现,幼年时期,存在于肉仔鸡小肠和盲肠中的主要菌群为乳酸杆菌,而随着日龄的增加,双歧杆菌在盲肠中变得更占优势,但本试验中,双歧杆菌属在盲肠内并没有优势条带出现,由于DGGE方法自身的限制性,如果某一菌属的含量低于总体水平的1%,那么很可能在图谱上就不能够反映出来,说明双歧杆菌在盲肠中的含量比较少或不能在盲肠内定殖.3.2不同菌株对肠道微生物的影响从本试验中可以看出,日粮中添加MOS对十二指肠、空肠、回肠和盲肠中微生物区系都有不同程度的改变.这些消化道中受影响的菌属主要包括:Lactobacillusgasseri(加氏乳酸杆菌)、Lactobacillusjohnsonii(约汉逊氏乳酸杆菌)、Lactobacillussalivarius(唾液乳酸杆菌)、Coprococcuscomes(陪伴粪球菌)、Ruminococcuslactaris(酸奶瘤胃球菌)和Clostridiumbartlettii(梭菌属).MOS能够与具有Ⅰ型菌毛(甘露糖敏感性外源凝集素)的病原菌和潜在致病菌结合,阻止其吸附在肠道黏膜上,打断了病原菌附着-繁殖-致病的途径,减少其在肠道定殖并诱发疾病的可能性,使