一种三七根结线虫全基因组dnapcr的制备及鉴定

一种三七根结线虫全基因组dnapcr的制备及鉴定

传统的线虫识别主要基于形态特征和形态测量值，但由于不同个体的形态特征多样性，很难区分形态特征。随着分子生物学的迅速发展,生物技术为植物病理的研究提供了重要的技术和手段,使利用核酸技术作为辅助手段进行线虫分类鉴定成为可能。Powers等对根结线虫的mtDNA进行RFLP分析,将4种常见的根结线虫区分开;Harris等根据北方根结线虫2号小种的mtDNA的一个1.8Kb的限制性酶切片段设计了一对引物用于4种常见根结线虫的鉴定;Zijlstra对核糖体基因的ITS区段进行了RFLP分析,将2种根结线虫M.hapla和M.chitwood区别开。笔者利用形态学方法初步将危害文山、砚山、马关、蒙自等地的三七根结线虫鉴定为北方根结线虫(论文另文发表),本试验以ITS序列为靶标,建立鉴定三七根结线虫的分子方法,作为形态学特征鉴定的有效补充。1材料和方法1.1感病番茄的种群纯化从三七根部选取受侵染的根,在解剖镜下,从根结中挑选色泽淡黄或黄色的单卵块,接种到预先培育在消毒土壤中的、已有25~30d苗龄的感病番茄植株根部,进行种群纯化、扩繁。共获得4个种群,即文山、砚山、马关和蒙自种群。以北方根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫为对照。1.2各品种的特异性引物MI-F/MT-R来自孟庆鹏等。在完成根结属线虫核糖体基因ITS区段克隆和测序的基础上,根据这1区段碱基编码序列,设计1对北方根结线虫特异性扩增引物,用于三七根结线虫的特异性扩增。MI-F:5GTGAGGATTCAGCTCCCCAG3’;MT-R:5’CAAGACCCAATGGCCATAGG3’;M18s:5’AACCTGCTGCTGGATCATTAC3’;M28s:5’GTATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’;Mh-F:5’CGAATAGTCTCAACGTTTATC3’;Mh-R:5’ATGTGACAGCGAAAAGAATT3’。各引物由上海生工(Sangon)生物合成。1.3不同预冷的k参照张立海等方法并作改进,挑取单条雌虫于含双蒸水(20μl)的凹玻片中,在解剖镜下用解剖刀将线虫切成数段,将线虫悬浮液吸入1.5mLEppendorf管中,加入8μl预冷的WLB液(2.5mMDTT,1.125%Tween20,0.0025%Gelatin,2.5×PCRbuffer)和2μl预冷的蛋白酶K(1mg/mL)。将Eppendorf管置于-70℃冰箱冷冻10min,65℃水浴恒温1h,95℃恒温10min,14000r/min离心1min,-20℃保存备用。1.4pcr和mh-f、mt-r扩增PCR反应体系50μl,包括:5μl10×PCRbuffer(500mMKCl,100mMTris,pH8.8,15mMMgCl2),1μldNTP(20mM),1μl引物1,1μl引物2,0.5μlTaqDNApolymerase(3units/μl,Takura公司),1μl模板DNA,最后加无菌双蒸水至50μl。引物MI-F/MT-R的PCR扩增条件为:94℃预变性3min,然后进入40个循环的扩增反应,即94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸1min。循环结束后再于72℃延伸10min,4℃保存。引物M18s/M28s的PCR扩增条件为:94℃预变性3min,然后进入40个循环的扩增反应,即94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min。循环结束后再于72℃延伸10min,4℃保存。引物Mh-F/Mh-R扩增条件为:94℃预变性3min,然后进入40个循环的扩增反应,即94℃变性30s,61℃退火40s,72℃延伸1min。循环结束后再于72℃延伸10min,4℃保存。1.5pcr扩增产物检测PCR产物每样品取5μl在0.5×TBE缓冲液中用1.5%琼脂糖凝胶电泳,经溴化乙锭染色后置于紫外照射仪上观察结果并照相。2结果与分析2.1根结线虫pcr扩增引物MI-F/MT-R对供试线虫的PCR扩增结果如图1所示。扩增结果表明,南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫均可扩增到779bp的分子片段,而北方根结线虫无扩增产物,与预期结果相吻合。供试文山、砚山、马关和蒙自的根结线虫种群均无扩增产物,表明该4个三七根结线虫种群不属于南方根结线虫和花生根结线虫,也不属于爪哇根结线虫。2.2图1:美国监狱警察-区引物M18s/M28s对供试线虫ITS区段的PCR扩增结果如图2所示。结果表明,所有供试线虫(包括对照线虫)均扩增到544bp长的片段,片段之间无多态性,只是根据ITS-PCR扩增结果无法区分北方根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫。2.3南方根结线虫、花生根结线虫、嘴唇根结线虫扩增产物的检测北方根结线虫特异性引物Mh-F/Mh-R对供试线虫PCR扩增结果如图3所示。扩增结果表明,北方根结线虫扩增到462bp的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫无扩增产物,与引物设计相符。供试文山、砚山、马关和蒙自三七根结线虫种群均扩增到462bp的分子片段,表明供试的三七根结线虫种群均为北方根结线虫。3pcr扩增结果(1)由于根结线虫具有寄主范围广、致病性强、繁殖快、易传播扩散的特性,加之线虫侵染造成的伤口有利于病菌侵染,加重了对作物的危害,成为威胁农作物生产的重要病原物。目前控制根结线虫病的主要途径是化学防治、使用抗病品种、建立无病种苗生产基地和植物检疫等,因此,对病原根结线虫种类的准确鉴定具有重要的现实意义。本研究建立了三七根结线虫的快速PCR鉴定方法,该方法的PCR引物的扩增目标序列为rDNA区域,其设计依据三七根结线虫病原与南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫在该区域的核酸序列上的差异,通过对4种常见根结线虫的测试,验证了该对引物对三七根结线虫病原——北方根结线虫的特异性和可靠性。(2)引物MI-F/MT-R和Mh-F/Mh-R对三七根结线虫的鉴定结果相吻合。引物MI-F/MT-R对南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫可扩增到大小相同的片段,北方根结线虫则无扩增产物,用此对引物可将北方根结线虫与其它3个种根结线虫区分开。此对引物对三七根结线虫无扩增产物,表明三七根结线虫不属于南方根结线虫、花生根结线虫,也不属于爪哇根结线虫。而利用北方根结线虫特异性引物Mh-F/Mh-R对三七根结线虫能专一地扩到目的片段,表明三七根结线虫为北方根结线虫,2对引物鉴定结果相同。(3)在对根结线虫进行分子鉴定中,