根结线虫与植物互作的分子信号识别、调节及表达

根结线虫与植物互作的分子信号识别、调节及表达

根结线虫是植物内寄生虫的线虫，属于异皮亚类。在世界范围内,植物寄生性线虫每年造成约1000亿美元的损失,其主要来自固定性内寄生线虫危害,特别是大约60种根结线虫(RKN)的危害。根结线虫适应性强,传播途径多样,寄主范围广泛,可侵染多种植物。植物寄生性线虫与寄主的关系是在长期进化过程中形成的。在根结线虫与寄主植物相互作用中,分子信号识别、互作起着重要作用,而线虫分泌物是诱导和保持巨型细胞的重要分子信号。通过分子水平的研究,确定了大量与根结线虫侵染和巨型细胞相关的基因,确定了线虫致病基因和植物抗性基因,但是研究较详细的只有少数基因。1线虫肠道腺的功能根结线虫通过分泌特有的食道腺分泌物作用于植物根尖的1至数个细胞,改变其正常基因表达,并形成巨型细胞,以利于自身生长发育。现已经确定了许多根结线虫分泌蛋白,取得了突破性的进展。线虫分泌型蛋白在侵染及建立寄生关系中起着重要作用。根结线虫首先通过头部敏感的化感器(Amphid)寻找植物的根,确定适当的侵染部位,并在侵入后对合适的根尖细胞进行口针穿刺以确保形成巨型细胞。在寄主体内,线虫的真皮及表皮都产生抗寄主的防御蛋白,如SOD、硫氧还蛋白氧化酶、脂氧化酶、抑制蛋白等,阻止寄主依赖茉莉酸途径的防御反应。根结线虫有两个重要的寄生专化器官:口针和食道腺。食道腺的分泌物通过口针进入植物细胞,引发复杂的生理生化变化,刺激细胞核进行有丝分裂,但细胞质却不分离,最终形成多核的巨型细胞,成为线虫的营养库。线虫口针分泌物通常含有巨型细胞形成的信号物质,同时也含有线虫在植物体内移动及穿刺细胞,降解、修复寄主细胞或是形成巨型细胞所需要的酶,如:纤维素酶、几丁质酶、伸展蛋白、果胶酸裂解酶、β-1,4内木聚糖酶、葡聚糖醛酸酶、交换蛋白等。一般认为亚腹食道腺(SvG)分泌物在侵染早期阶段起到重要作用,而背食道腺(DG)分泌物在形成和保持巨型细胞中起到重要作用。通过对分泌物的分析,证实了蛋白和碳水化合物的存在,但不存在核酸类物质。Jaubert等在线虫食道腺分泌物中发现了钙牵蛋白(MI-CRT)和14-3-3蛋白,这两种蛋白都具有复杂的功能,涉及信号调节、代谢调控和细胞周期的调控等。事实上,钙牵蛋白和钙结合蛋白也存在于人类或动物寄生性线虫的分泌物中,并在其它分泌蛋白的形成中起分子伴侣的作用。Ding等比较了寄生前和寄生时南方根结线虫(M.incognita)二龄幼虫表达的差别基因,发现了亚腹食道腺分泌的纤维素结合蛋白(MI-CBP-1)和类过敏性毒蛋白的cDNA。Rodrigo等第1次报道了从南方根结线虫的二龄幼虫中分离出丝氨酸蛋白酶基因(Mi-ser1),并推导了氨基酸序列,它具有类似胰凝乳蛋白酶的作用。根结线虫还可产生一些独特功能的分子信号。如食道腺中表达1种特殊的酶——分支酸变位酶,是一种与类黄酮合成相关的酶。分支酸是芳香族氨基酸合成的前体,与IAA、水杨酸类化合物紧密相关。线虫的分支酸变位酶基因MjCM-1的转基因表达抑制了大豆次生根和维管组织的形成。多聚葡萄糖的次级产物在植物中具有一定的功能,涉及到生长调节、分化和防御反应,它们的同族产物、前体及细胞分裂素被证实存在于根结线虫和孢囊线虫的幼虫溶解物中。这些激素是类脂类化合物,能够刺激植物细胞的分化,在根结线虫建立寄生关系时起重要作用。Huang等和McCarter等构建了根结线虫(Meloidogynespp.)食道腺分泌物的cDNA消减文库,并对分泌物进行了分析。2复杂的基因表达根结线虫在侵入、转移、刺激巨型细胞形成中诱导寄主植物复杂的基因表达,包括线虫造成的伤口反应、亲和反应、抗性反应等,涉及分子识别,信号传导、放大及表达等一系列基因表达过程。2.1启动子相关基因根结线虫二龄幼虫在侵染寄主植物时,首先激活降解细胞壁的酶的基因,如葡聚糖酶基因(ENG)和半乳糖激酶基因(PG)。其次是与巨型细胞形成相关的蛋白基因,如胶质乙酸乙酯酶基因(PAE)、伸展蛋白(Extensin)、微管蛋白(Tubulin)、肌蛋白(Actin)等基因。还有许多细胞周期调控基因可被根结线虫激活,如:早期生节因子ENOD40和核内复制因子CCS52a,在根结线虫侵染的拟南芥根部细胞内含有高转录活性的标记基因,如:周期蛋白激酶基因cdc2a和细胞周期蛋白基因cyc1At。另外,有报道植物激素反应因子,如CH3、甘露氨酸合成酶启动子Tr2、Nodulin26、Knotted1等为与巨型细胞形成相关的基因。二胺合铜氧化酶基因(ATAO1)、拟南芥唐松草碱形成素基因(AtFH6)在巨型细胞的形成中起着重要的作用。巨型细胞的活性需由一系列的基因表达维持,如:泛素蛋白酶、HSP70、羟甲基CoA降解酶、RNA聚合酶Ⅱ等,它们在巨型细胞中都是上调表达,维持巨型细胞的高活性代谢。Lea(Lateembryogenesisabundant)基因在巨型细胞中是上调表达,它与巨型细胞的渗透压相关,使巨型细胞维持大量的营养和水分,以供线虫需求。在根结线虫的巨型细胞和其周围的细胞中,负责养分传递的基因SUC和水通道基因TobRB7大量表达,有利于营养向巨型细胞聚集。一些转录因子在巨型细胞中是强烈表达的,如质膜ATP质酶(Myb型转录因子)、TobRB7。TobRB7是在巨型细胞中特异表达的专化启动子。通过GUS基因研究的TobRB7启动子在根结线虫侵染后明显增强,在巨型细胞中它被一个300bp的上游片段强烈激活。其它类型的转录因子,如PHAN和KNOX转录因子也在巨型细胞中表达。另外一些基因受根结线虫侵染负调控,多是病原防御基因,例如:AtPLI和AtEREBP等均被认为是由于线虫侵染抑制了寄主的防御反应,这些基因通常是病原诱导的植物启动子。花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、农杆菌的nos、rol启动子在巨型细胞中是下调表达。2.2根结线虫感染抗御反应的机制寄主植物通常以防御反应来应对根结线虫的入侵和寄生。一种主要的抗性反应是过敏性坏死;另一种抗性反应则是抑制巨型细胞的形成;还有一种方式是将线虫排除在维管束之外。在番茄(L.esculentum)上接种根结线虫(M.javanica)12~24h内就可以观察到伤口反应和防御反应。表达的防御基因产物主要有:过氧化物酶、几丁质酶、脂氧化酶等。诱导的防御基因产物不仅包括上调的防御蛋白,如胰岛素类物质、伸展蛋白,还包括植保素,如纤维素、木质素等。在这些物质合成中涉及的酶包括羟甲基CoA降解酶和苯丙烯醛合成酶,这些酶与根结线虫(M.javanica)早期侵染引发的寄主防御反应相关。而根结线虫的一些功能未知的分泌物和降解产物可能具有植物抗性反应激发子的作用。通过PCR技术和cDNA文库的建立,发现根结线虫可以诱导抗性番茄的变味蛋白LeMir基因表达,它编码的类似于非洲奇果蛋白的物质具有抗微生物的作用,它与大豆胰岛素抑制剂家族相似,这个家族的几种物质都具有抗昆虫、抗病原菌的作用。Lambert等还发现抗坏血酸自由基(AFR)还原酶可阻止AFR转化为抗坏血酸盐,增加维生素C的量,防止伸展蛋白的降低。在巨型细胞形成过程中,植物中编码羟甲基戊二酸单酰CoA的hmg2基因被强烈的激活。而番茄的hmg2基因是真菌和细菌诱导的防御相关基因。根结线虫侵染也可以诱导一些启动子的表达,如Wun1启动子、WRKY转录因子。其中,WRKY转录因子在许多植物的防御反应中起作用。通过试验,一些防御性产物在感性品种也可以表达,但在抗性品种中表达较快,而在感病品种中表达的较慢,如几丁质酶等。有些蛋白在线虫的分泌物和感性品种中都有表达,但是它们的作用却是有差别的,如内切葡聚糖酶,在线虫的分泌物中主要作用是降解寄主植物的细胞壁,以利于线虫在寄主体内的移动,而寄主表达的内切葡聚糖酶主要作用是形成巨型细胞。与根结线虫分泌物相似的一些蛋白在抗性寄主植物中也有表达,如伸展蛋白在线虫分泌物中主要是用于巨型细胞的形成,而在抗性植株中的大量表达则可以抵御线虫的入侵。另外,通过抗、感性品种对线虫侵染后的生物电压分析,证明钙离子通道在决定抗感性中起着重要的作用。2.3病原线虫所携带的非毒性基因的识别植物自然抗根结线虫基因具有高度的专化性。只有病原线虫携带有非毒性基因时才能被植物识别,发生防御反应。已经发现的植物抗根结线虫基因主要的有以下几类。2.3.1设根结线虫时诱导大型细胞的形成该基因抗3种主要的根结线虫:南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)。Mi基因是通过种间杂交胚胎挽救法从番茄野生种(Lycoperisiconperuvianum)导入栽培种(L.esculentum)中的。Mi基因抗性表现为侵染点附近的细胞过敏性坏死,最早的可见反应发生在接种12h,正是根结线虫开始诱导巨型细胞形成时。然而,Mi基因具有热敏感性,抗性在高温高于28℃下可以消失,温度试验证明,决定抗性的温度仅仅发生在侵染后的24~48h内,超过这个时间段,即使温度合适也不再表现出抗性。Mi基因在高温下抗性降低可能是由于过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性增加降低了超氧化物和过氧化氢的含量而使抗性降低,这两种物质都与木质素的合成紧密相关。现在发现水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)均与Mi基因的抗性表达相关。Mi基因定位于番茄6号染色体上,具有核苷酸结合位点和亮氨酸重复区(NBS/LRR),编码含有1257个氨基酸的蛋白。Mi基因与其它植物抗病基因具有相似性,并且经常与其它的抗性基因成簇存在,例如Mi基因与抗真菌基因cf2和cf5的距离只有1cM,并且具有抗蚜虫(Macrosiphumeuphorbiae)的作用。Mi基因是一个重要的抗线虫基因家族,目前已发现了9个Mi基因,分别称作为Mi-1~Mi-9,其中以Mi-3和Mi-5基因应用价值较大。温敏性的显性基因Mi-3与热稳定性基因Mi-5对南方根结线虫的毒性群体都表现抗性,它们被定位在12号染色体的远端,并且紧密连锁。2.3.2根结线虫的抗性该类基因存在于辣椒中,其来源、抗性谱范围、抗病机制、对温度的敏感性各有不同(表1)。研究者通过双单倍体群体,在PM217和PM687共发现了5个抗病显性基因(Me1~Me5),其中以Me1、Me3抗性谱较广,抗3种主要的根结线虫M.incognita、M.javanica、M.arenaria,而Me2、Me4、Me5分别控制了一种根结线虫的抗性,或是仅仅抵抗某些小种,Me2抗M.javanica,而Me4抗M.arenaria。Me1、Me3两个基因虽然抗性谱相近,但作用方式和对温度的反应却不相同。Me1的抗性反应开始于幼虫在取食位点固定之后,抗性反应较慢,主要发生在巨型细胞形成过程中,在高温下其抗性会部分丧失。而通过超微结构观察证实Me3基因表现为幼虫与根接触时就即刻在侵染点附近产生过敏性坏死,并在42℃的高温下也能保持完全活性。Me基因和Mi基因的抗线虫性状相似,但两者分属于两类抗线虫基因,选出的抗Mi基因的毒性根结线虫不能侵染含Me基因的辣椒,反之亦然。2.3.3抗黄虫基因检测Hare将他在辣椒中发现的第一个抗线虫基因定名为N,来源于野生辣椒SantakaXS,为单显性基因,抗M.incognita、M.javanica、M.arenaria对温度表现不稳定,在28℃以上会丧失部分抗性,在线虫侵入后可在线虫周围发现坏死。Vito等在野生材料中也发现了几个抗性基因,这些基因均对温度表现稳定。在我国也发现有很多的辣椒材料具有抗根结线虫基因,这些都有待于进一步的开发研究。Zhang等在棉花(GossypiumhirsutumL.)上接种根结线虫后,发现了一种抗线虫基因MIC-3,它编码14kD的蛋白。在果树、莴苣、鹰嘴豆、烟草中分别发现了抗根结线虫的基因。在胡萝卜上也发现对根结线虫(M.hapla)的抗性是由两个隐性基因控制。3植物与昆虫的共生研究3.1其他研究方向3.1.1线虫氧化物降解细胞的作用机制首先,根结线虫通过头部的化感器寻找寄主植物根,确定侵染部位;在根内则用于识别可刺激形成巨型细胞的根细胞,但这一过程的机制现在仍然不清楚。其次,线虫分泌物在抗、感性寄主中的差异,在植物体内、体外的差异,分泌物降解途径等均缺乏详细的研究。另外,线虫分泌物的成分可直接注入细胞质内与受体结合,还可以通过细胞质膜外部成分间接调控,甚至是直接的进入细胞核调控受体细胞的基因表达。这些研究将有助于认识线虫与寄主之间的分子互作。3.1.2线虫诱导表达基因及启动子组成当根结线虫侵染时,寄主植物的早期基因表达是根结线虫和寄主植物信号识别、互作的重要部分,对线虫诱导表达基因及其启动子组成进行分析是研究分子互作和抗性研究的基础。通过多个抗性基因的表达分析,可以发现抗性植物的共同表达基因,为进一步采用生物技术提高植物的抗性奠定基础。3.1.3根结线虫中的隐性非毒性基因带有毒性基因的线虫可以克服寄主抗性。通过研究证实在线虫的非毒性基因与植物抗性基因之间存在着基因对基因的关系,并且病原线虫中的显性非毒性基因控制着这种相互作用。在温室及田间都存在着对Mi基因毒性的根结线虫群体。通过对根结线虫(M.incognita)雌虫毒性群体和非毒性群体的对比,确定了在非毒性群体中存在着一种蛋白(map-1),它是由非毒性基因编码。然而由于抗Mi基因的毒性根结线虫只能进行孤雌生殖,不能产生有性繁殖,所以很难确定这个基因的遗传方式。3.1.4土地特异性基因的转录启动子当南方根结线虫侵染时,根部的许多启动子活性增加,这可用于发现根部特异表达的启动子,如TobRB7。线虫在植物组织中是一个很突出的靶标,但转基因要求精确的基因位点调控,非专化的或是过度的表达都会对植物产生危害。因此,线虫诱导的根部特异表达的转录启动子具有重要作用。通过巨型细胞专化启动子TobRB7构建的反义基因载体在植物体内表达,在温室和田间可以减少根结70%。3.2研究策略3.2.1mi基因在辣椒抗病品种中的应用采用常规育种方法利用天然抗线虫基因仍然是主要途径。现在已经克隆的天然抗性基因主要集中于番