天蚕素抗菌肽对海兰褐蛋用仔鸡血液免疫指标和肠道菌群的影响

天蚕素抗菌肽对海兰褐蛋用仔鸡血液免疫指标和肠道菌群的影响

现在，随着传统抗生素抗剂性的增多，抗剂性疾病的日益严重，导致动物体的免疫水平降低，并在动物和环境中残留大量残留，危害水产养殖的健康发展，影响人类食品安全、抗生素资源的利用和生物环境的开发。因此，绿色安全、高效、无残留的抗生素产品的开发已成为必然趋势。天蚕素抗菌肽是最早发现于惜古比天蚕蛹血淋巴细胞中的动物源抗菌肽,目前发现的大约有89种,它广泛存在于生物体内,具有分子质量小、水溶性好、热稳定性强等特点,而且呈碱性,具有很强的阳离子特征,且对较低或较高的pH和较强的离子强度都有一定抗性作用。抗菌肽的作用靶点是细胞膜,通过在细菌细胞膜上穿孔形成孔道,造成细胞膜结构破坏引起细胞内物质泄漏导致电化学势的丧失,从而使靶细胞死亡而达到抗菌的效果。因其作用于结构而非功能上,因此不易产生细菌耐药性,其作为一种新型的抗生素替代品具有广阔的应用前景。前人对天蚕素抗菌肽的研究主要集中在分离纯化与鉴定以及抗微生物活性等方面,在动物生产方面的应用较少。尤其是在蛋用仔公鸡上的应用,目前鲜有报道。在动物饲粮中分别添加适量抗生素和不同水平抗菌肽,研究两者对蛋用仔公鸡各试验指标的不同影响,进一步比较抗生素与抗菌肽之间的优劣性,以及其在畜禽饲粮中添加效果及适宜添加量的确定有待于进一步研究。本文旨在通过在海兰褐蛋用仔公鸡饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽,研究其对蛋用仔公鸡血液免疫指标和肠道菌群的影响,为进一步指导生产提供科学依据。1材料和方法1.1试验材料试验所用天蚕素抗菌肽由国家饲料工程技术研究中心研制,北京中农颖泰生物技术有限公司生产。试验所用抗生素为金霉素。1.2鸡群的饲养及护理选用336只1日龄健康的海兰褐蛋用仔公鸡(购自北京农业职业技术学院种鸡场),平均体重为(39.14±0.17)g,3层笼养,试验鸡只自由采食饮水,其他免疫和消毒措施遵照鸡场正常程序进行,每天观察鸡群健康状况,并记录试验数据。饲养试验在中国农业科学院南口中试基地鸡舍进行。1.3各组初始体重比较见表1将336只1日龄海兰褐蛋用仔公鸡随机分为7组,分别为基础饲粮组(对照组)、基础饲粮+150mg/kg金霉素组(抗生素组)、基础饲粮+150mg/kg抗菌肽组(抗菌肽Ⅰ组)、基础饲粮+200mg/kg抗菌肽组(抗菌肽Ⅱ组)、基础饲粮+250mg/kg抗菌肽组(抗菌肽Ⅲ组)、基础饲粮+300mg/kg抗菌肽组(抗菌肽Ⅳ组)、基础饲粮+350mg/kg抗菌肽组(抗菌肽Ⅴ组),每组4个重复,每个重复12只鸡,各处理初始体重差异不显著(P>0.05)。饲养试验期为42d。1.4试验饲料以玉米-豆粕型饲粮为基础饲粮,按NY/T33—2004鸡饲养标准配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。1.5指标测定1.5.1血浆溶菌酶活性测定于试验第42天,每个重复随机选取2羽鸡,心脏采血5mL/只,3000r/min离心10min,分离血浆,用移液枪吸出分装于Eppendorf管后置于-20℃冰柜中保存,用于测定血浆溶菌酶、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)、补体4(C4)含量。IgA、IgG、IgM含量采用放射免疫分析法进行测定,采用鸡专用试剂盒。C3、C4含量采用酶联免疫试剂盒双抗体夹心法测定,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD)值,通过标准曲线计算样品中C3、C4含量。溶菌酶含量采用免疫比浊法,试剂盒购于北京康源瑞得生物技术有限公司。1.5.2稀释液的稀释和双歧杆菌的培养于试验第42天,每个重复中随机选取2羽鸡进行屠宰,在回肠和盲肠接口处用细线紧紧结扎(保持盲肠内容物与外界隔绝,以防污染),然后将扎口的盲肠取下,液氮保存,放置于-80℃冰箱中保存,用于测定内容物中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌数量。试验时,将盲肠段置于常温下自然解冻,无菌操作台内称取0.5g食糜于离心管中,加入已灭菌生理盐水4.5mL,置于涡旋振荡器上充分振荡混合均匀,依次10倍递比稀释至1×10-7,预试验选择3个合适的稀释度。选择稀释度为1×10-1~1×10-3盲肠内容物稀释液,取20μL稀释液接种到麦康凯培养基中进行大肠杆菌培养。选择1×10-2~1×10-4的稀释度,取20μL稀释液接种到MRS培养基中,在厌氧管中通入氮气进行乳酸杆菌培养。选择1×10-3~1×10-5的稀释度,取20μL稀释液接种到改良MRS培养基中,进行双歧杆菌培养。培养皿用封口膜密封,大肠杆菌37℃恒温培养24h,乳酸杆菌、双歧杆菌37℃恒温培养36h,取出计数。采用活菌计数法测定,所有步骤按微生物操作规程进行。1.6分析并进行多重比选,显著推动anoa显著性分析并进行多重比较,表面活性剂的选择利用,进行多重比较,选择合适的重利用Excel软件对各重复原始数据进行处理,采用SPSS17.0软件ANOVA进行显著性分析,并采用Duncan氏法进行多重比较。测定结果以“平均值±标准差”表示。2结果2.1抗菌酶对蛋用鸡的血液免疫指标的影响2.1.1抗菌肽对iga和igg含量的影响由表2可知,在IgA含量上,抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与对照组和抗生组差异不显著(P>0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于对照组和抗生素组(P<0.05),且与抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组差异显著(P<0.05)。抗菌肽Ⅴ组IgA含量最高,较对照组和抗生素组分别提高了21.22%和17.12%。在IgG含量上,抗生素组及抗菌肽组均显著高于对照组(P<0.05),抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗生素组(P<0.05),抗菌肽Ⅰ组与抗生素组差异不显著(P>0.05)。抗菌肽Ⅴ组显著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组显著高于抗菌肽Ⅰ组(P<0.05)。抗菌肽Ⅴ组IgG含量较对照组和抗生素组分别提高了67.20%和34.48%。在IgM含量上,各组之间差异不显著(P>0.05)。2.2.2各组患者ct、溶菌酶含量比较由表3可知,在C3含量上,各抗菌肽组均显著高于对照组和抗生素组(P<0.05),且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05)。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组C3含量较高,较对照组分别提高了77.36%和81.01%,较抗生素组分别提高了57.18%和60.41%。在溶菌酶含量上,抗生素组及抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组显著高于对照组(P<0.05),分别比对照组提高了28.89%、28.91%、44.46%、48.90%。抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组溶菌酶含量与抗生素组相比均有提高,但差异不显著(P>0.05)。2.3各组盲肠双歧杆菌数量的比较由表4可知,对大肠杆菌数量的影响,各抗菌肽组与对照组相比显著降低(P<0.05),且抗生素组显著低于对照组(P<0.05),抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组与抗生素组差异不显著性(P>0.05),抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组显著低于抗生素组(P<0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著低于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05)。抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组盲肠大肠杆菌数量分别比对照组降低了6.42%、8.51%和8.83%,比抗生素组降低了3.48%、5.63%和5.96%。对双歧杆菌数量的影响,抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组和抗生素组显著高于对照组(P<0.05),抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗生素组和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05),但与抗菌肽Ⅲ组差异不显著(P>0.05)。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组盲肠双歧杆菌数量与对照组相比分别提高了4.72%、4.87%,与抗生素组相比分别提高了2.16%、2.30%。对乳酸杆菌数量的影响,抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于对照组(P<0.05),各抗菌肽组与抗生素组差异不显著(P>0.05),但随着饲粮中抗菌肽添加量的不断增加,乳酸杆菌数量呈一定的增长趋势,抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05)。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组盲肠乳酸杆菌数量与对照组相比分别提高了2.30%、2.68%,与抗生素组相比分别提高了1.14%、1.52%。3讨论3.1各组日金融平均日摄食量、料重比以及料重比的比较刘莉如等研究了饲粮添加不同水平抗菌肽对蛋用仔公鸡生长性能的影响,结果表明,抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与对照组相比,平均日采食量显著降低,各抗菌肽组之间平均日采食量差异不显著。各组平均日增重差异不显著。抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组与对照组相比,料重比显著降低,但各抗菌肽添加组与抗生素组之间料重比差异不显著。这说明饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽可在不同程度上提高蛋用仔公鸡的生长性能。3.2抗菌肽对免疫调节的影响体液免疫是动物特异免疫的一个重要方面,抗体对病原体及毒素的中和作用、免疫调理、吞噬作用以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用都与免疫球蛋白水平有密切关系,免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM等)是介导体液免疫的主要抗体,也是衡量机体免疫功能的重要指标。IgA主要由浆细胞产生,分为血清型和分泌型。血清型IgA具有多种抗体活性,包括抗菌、抗毒素、抗病毒等作用。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,约占其总量的75%。IgG是抗感染的主要抗体,可通过经典途径激活补体,对细胞性抗原可产生抗体依赖性的细胞介导的细胞毒(AD-CC)作用及调理作用。IgM主要由淋巴组织和脾脏中的B细胞产生,为B细胞表面表达最早的抗体,在机体感染早期起主要作用。C3和C4是补体系统的主要成分,在抵抗微生物感染方面起重要作用,激活后具有免疫调节、介导炎症反应、中和毒素、免疫复合物溶解和清除等重要的生物学效应。溶菌酶是巨噬细胞活化时释放的一种水解酶,通过降解细菌多糖细胞壁杀灭细菌,检测血浆溶菌酶含量可以评价动物机体的免疫状态。Robert等研究报道,抗菌肽可以防止感染扩散,提高体内IgG含量。王阿荣研究表明,饲粮中添加适量的天蚕素抗菌肽对血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量无显著影响,但能够降低断奶仔猪血清尿素氮的含量,提高血清IgG含量,最适添加量为320g/t。郑云峰等在断奶仔猪基础饲粮中添加饲料肽产品,结果表明,2%添加量组IgG含量显著高于其他各组。王静的研究结果表明,饲粮中添加不同水平抗菌肽粗提品能显著提高肉鸡21日龄血清C3、C4含量和35日龄C3与溶菌酶含量。本试验中,饲粮中添加不同水平的抗菌肽可提高蛋用仔公鸡血液中IgA、IgG、溶菌酶和C3含量,并且随着添加量的增加,各血液指标表达水平有逐渐上升趋势。这与上述研究报道等一致,说明在蛋用仔公鸡饲粮中添加天蚕素抗菌肽可在一定程度上提高机体的体液免疫功能,增强机体免疫力。本试验中,各组IgM、C4含量差异不显著,这同王静的研究结果不一致,可能是由于鸡的品种、日龄、饲养环境、试验时间、动物机体状态不同等原因导致的。3.3抗菌肽对鸡肠道微生物微生态的影响肠道微生物能对营养、免疫、疾病防治以及生理功能的发挥产生重要影响,进而影响鸡的生长和健康。倪学勤等采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)相结合的方法对肠道内容物菌群16SrDNAV3区所绘的PCR-DGGE指纹图谱进行分析,结果表明,蛋鸡消化道不同部位细菌的组成都不一样,盲肠内细菌种类在不同周龄蛋鸡中均表现最丰富,其次是回肠,而空肠、嗉囊和十二指肠细菌种类相对比较少。在畜禽小肠中微生物数量最高的部位在盲肠,盲肠内容物pH为5.1~7.0,且具有较高的营养价值,在代谢过程中意义重大。盲肠是鸡消化道微生物活动最大的器官,虽然目前对鸡盲肠微生物微生态学的研究远没有反刍动物瘤胃和猪后肠微生物微生态学的研究深入,但是研究盲肠内容物中微生物的正常肠道菌群,对防治肠道感染疾病具有很高的实用价值。张熠等报道在饲粮中添加外源性抗菌肽能抑制病原菌,而对肠道正常菌群和机体细胞则无杀伤作用。陈晓生等试验结果表明,不同抗菌肽添加水平对肉鸭雏鸭期肠道内大肠杆菌、乳酸杆菌均有显著抑制作用,与金霉素相比,抗菌肽对大肠杆菌的抑杀效果更好。王静在肉鸡饲粮中添加不同水平抗菌肽,结果表明,抗菌肽能够降低21、35日龄肉鸡肠道大肠杆菌数量,300mg/kg添加水平能提高肉鸡35日龄肠道乳酸杆菌群数量,效果优于抗生素组。李丽在饲粮中分别添加不同水平抗菌肽,结果表明,抗菌肽能够降低肠道食糜中有害的大肠菌群的数量,而对有益的乳酸菌菌群数量有提高趋势。本试验在饲粮中添加不同水平抗菌肽均能有效降低肠道致病菌大肠杆菌数量,尤其是高剂量抗菌肽组能显著增加肠道益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量,与上述报道结果基本一致,这说明抗菌肽可有效调控肠道菌群平衡,可以调节肠道不同菌群的数量,改善肠道的微生态环境,有利于蛋雏鸡肠道微生态平衡的迅速建立和维持,对维持机体稳态意义重大。陈晓生等的研究发现,将蚕抗菌肽AD-酵母液体制剂直接