宫颈细胞中hpv16e6基因的荧光定量检测

宫颈细胞中hpv16e6基因的荧光定量检测

宫颈是发展中国家女性最常见的肿瘤。高危型的人乳头瘤病毒(HPV),特别是HPV16型被认为是该肿瘤的主要病因。HPV16基因组主要由早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和长控制区(LCR)组成,E区有6个开放读码结构(ORF),即E1、E2、E4、E5、E6及E7,其中与转化有关的为E6和E7基因。HPV致癌的关键是转化蛋白E6、E7与细胞癌基因和抑癌基因相互作用。E6蛋白独立致癌性日益受到重视。而新疆妇女宫颈癌组织中HPV16E6(新疆株)(AF327851)与德国标准株相比发生了碱基突变和相应的氨基酸序列改变,其可能成为新疆妇女宫颈癌高发的主要诱因。为此,我们对新疆妇女宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)、疑似宫颈癌而病理结果为炎症(宫颈炎)的蜡块组织及甲醛浸泡的宫颈癌组织提取的DNA并检测了其中HPV16E6基因;另外对一批妇科门诊患者随机取宫颈管的脱落细胞及分泌物作为对照,初步了解新疆妇女HPV的感染状况。采用荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)方法,对上述5组不同患者的宫颈组织细胞进行了HPV16E6检测,同时设立细胞内参照β-肌动蛋白,利用荧光标记的探针对扩增的目的基因进行即时杂交,测定其荧光强度并与细胞内参照的荧光强度进行比较,从而达到对目的基因进行量化分析的目的,使该研究方法能够在未来用于宫颈癌的早期筛查,指导临床治疗,监测病情变化,并可能应用于该病的风险评估和放疗的疗效观察。对象和方法一、因妊娠和宫颈炎而产生的各组宫颈脱落细胞标本随机采自新疆医科大学第一附属医院妇科门诊患者,由医生在无菌操作下用棉拭子刷取宫颈脱落细胞,并置于无菌生理盐水中,充分震荡洗涤,密封送检。宫颈脱落细胞组共96例,其中汉族78例,维吾尔族16例,哈萨克族2例。宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈炎蜡块组织由新疆医科大学第一附属医院病理科提供,共157例:蜡块组织中宫颈癌59例,其中维吾尔族45例,汉族13例,柯尔克孜族1例。CIN组共65例,其中汉族41例,维吾尔族22例,哈萨克族2例。宫颈炎组共33例均为维吾尔族。切取8μm厚石蜡切片3片,放入高温灭菌的离心管中室温保存待用。另有10例的宫颈癌标本来自新疆喀什,均为维吾尔族。二、方法1.探针及引物合成根据已注册的HPV16E6基因序列(GenBankAF327851),利用DNAMAN软件设计如下引物序列:上游引物5′CACAGGAGCGACCCAGAAA3′和下游引物5′GACATACATCGACCGGTCCAC3′,扩增片段长约400bp,根据扩增片段的序列,利用英国premier公司的BeaconDesigner软件设计探针序列:5′(FAM)ACCACAGTTATGCACAGAGCTGC(TAMRA)3′;引物及探针分别由日本TaKaRa公司和加拿大Sangon公司合成。细胞内参照β-肌动蛋白基因引物、探针,取自美国PerkinElmer(PE)AppliedBiosystems公司的β-肌动蛋白Controlreagentskit。dNTP,Taq酶购自日本TaKaRa(大连)公司。DNA模板提取所用试剂(包括蛋白酶K)购自加拿大Sangon公司。2.仪器主要为美国PerkinElmer(PE)公司的5700荧光定量PCR仪。3.因子检测细胞dna宫颈脱落细胞标本DNA提取方法按照中山大学达安基因诊断中心的FQ-PCR试剂盒操作规程进行,DNA提取液由该中心提供。得到的宫颈脱落细胞DNA溶液在-20℃冷藏备用。甲醛溶液浸泡的宫颈癌组织DNA的提取方法,在徐来祥等方法的基础上进一步优化改进。石蜡包埋组织DNA提取,首先用二甲苯对组织切片脱蜡,使细胞与消化液充分接触,保证了组织的完全破碎,DNA释放和蛋白去除更加完全。4.pcr检测pucm-t、pv136的荧光强度与获得力β-肌动蛋白标准梯度由试剂盒给定。HPV16E6标准梯度按如下方法建立:将本实验室的pUCm-T/HPV16E6提取纯化后用TE缓冲液[10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA(pH8.0)]稀释成103~107copy/μl,经定量PCR检测其荧光强度与拷贝数的线性关系后确定。5.目的基因片段的扩增总体积50μl,内含dNTPs200μmol/L,上下游引物各0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,探针6pmol,缓冲液(25℃pH9.0的10mmol/LTrisHCI,50mmol/LKCI,0.1%Triton×100)及MgCl2浓度值的确定按析因实验方案进行。反应缓冲液配制好后,分两管分别加入HPV16E6和β-肌动蛋白引物及其相应探针,加入模板量为1μl/管,分别扩增HPV16E6目的基因片段和β-肌动蛋白基因片段。扩增条件:95.0℃预变性5min,变性95.0℃45s,退火55.0℃45s,延伸72℃45s,循环40次,最后72℃延伸8min。实时检测荧光强度的变化,定量扩增完毕,每个样本得到两条荧光曲线及各自的拷贝值(CH&Cβ,HPV16E6拷贝数和β-肌动蛋白拷贝数),CH/Cβ即为所求组织所含HPV16E6DNA的相对数量值。6.mg2+浓度的析因设计固定变性温度,同时固定模板量及缓冲液,将Mg2+浓度和复性温度进行两因素三水平(分别以55℃和58℃为复性温度,Mg2+浓度分别为1.5mmol/L、1.75mmol/L及2mmol/L)的析因设计,使两因素的每一水平都有机会组合。当某一反应组得到Ct值较小荧光强度较高时,说明相对其他反应组而言,在模板量相同的情况下该组用较少的循环次数就可达到阈值,即其反应敏感性相对较高,因而该反应所对应的反应体系即为此次实验优化的“最佳”水平。7.ipv6基因片段以最终优化出的反应体系应用于扩增HPV16E6基因片段。在应用于临床标本前,进行4次HPV16E6和β-肌动蛋白基因片段FQ-PCR,以观察最佳反应体系的重复性和稳定性。8.-肌动蛋白基因片段的检测对临床获得的5组标本,核酸提取后,分别扩增目的基因HPV16E6和细胞内参照β-肌动蛋白基因片段,重复一组,取平均值之比即得到每一样本的CH/Cβ(copyHPV16E6/copyβ-肌动蛋白)值。9.统计处理用SPSS统计软件进行统计分析。将宫颈癌、CIN、宫颈炎的蜡块组织及对照脱落细胞检测结果差异显著性检验采用χ2检验和秩合检验。结果一、复性温度下荧光曲线分别以55℃和58℃为复性温度,Mg2+浓度分别为1.5mmol/L、1.75mmol/L及2mmol/L时进行实验;58℃为复性温度时均未得到阳性的荧光曲线;以55℃为复性温度的实验结果:FQ-PCR得到的Ct值及荧光强度最佳为MgCl22mmol/L组,用已知阳性模板进行稳定性及重复性实验(每次设立阴性对照组),结果稳定,标准曲线吻合度高。二、fq-pcr检测睾丸中-肌动蛋白、pv136表达情况维吾尔族宫颈癌患者共55例,年龄平均46.7岁(28~68岁);汉族宫颈癌患者14例,年龄平均48.8岁(34~72岁)。宫颈癌、CIN、宫颈炎的蜡块组织分别为59例、65例及33例。甲醛溶液浸泡的宫颈癌组织10例,宫颈管脱落细胞96例,各组β-肌动蛋白及HPV16E6阳性情况见表1。FQ-PCR检测宫颈癌组织中β-肌动蛋白、HPV16E6的标准曲线及扩增曲线分别见图1(a、b)及图2(a、b),标准曲线理想,结果可靠。宫颈脱落细胞标本96例中β-肌动蛋白阳性91例,HPV16E6阳性3例,阳性率3.3%;宫颈癌蜡块组织59例β-肌动蛋白均阳性,其中HPV16E6阳性49例,阳性率83.05%;宫颈上皮内瘤变(CIN)蜡块组织65例中,28例因β-肌动蛋白阴性被剔除,余37例β-肌动蛋白阳性者中,HPV16E6阳性28例,阳性率75.7%;宫颈炎的蜡块组织33例中,3例β-肌动蛋白阴性被剔除,余30例β-肌动蛋白阳性者中,HPV16E6阳性28例,阳性率93.3%;甲醛溶液浸泡的宫颈癌组织10例中2例β-肌动蛋白阴性被剔除,余8例中HPV16E6阳性4例,阳性率50%。三、免疫、cin、宫颈炎蜡块与pv18e6表达的秩合检验对β-肌动蛋白阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计分析,宫颈癌、CIN、宫颈炎各组HPV16E6阳性率与脱落细胞组HPV16E6阳性率间差异有显著意义,χ2值分别为100.5,75.1,95.98,P值均<0.005;而宫颈癌、CIN、宫颈炎蜡块3组之间HPV16E6阳性率差异无显著意义,P>0.05。在β-肌动蛋白阳性的宫颈不同病变组织中,HPV16E6阳性率及其相对含量见表2;秩合检验结果:不同病变组间HPV16E6的相对含量差异显著,宫颈癌蜡块组织HPV16E6的相对含量高于各CIN组及对照脱落细胞组,P<0.05;CIN各组又高于对照脱落细胞组,P均<0.01。对宫颈不同病变组织单位细胞所含HPV16E6DNA的定量值用Spearman相关分析进行统计学处理:HPV16E6的相对含量随病情加重(从正常脱落细胞组到宫颈癌)有上升趋势(图3),相关系数r=0.83,P<0.01。各指标检测的差异世界范围的研究表明人乳头瘤病毒是引起宫颈癌的主要病因之一,97%的宫颈癌患者中都有HPV检出。虽然巴氏涂片法的细胞学检测在早期宫颈病变诊断中扮演着重要的角色,但是HPV的DNA检测可以在CIN选择治疗、病情预测中提供重要的参考。HPV实验室检测方法很多,常规PCR技术简便、快速、灵敏,但存在着不能定量、易被污染、易假阳性等缺陷。而核酸荧光定量PCR技术可克服上述问题,它是近几年发展起来的新的核酸检测技术,该技术在常规PCR基础上,加入了1条用荧光基团标记的特异性探针。在PCR反应过程中,实时检测反应体系中荧光信号的变化,待反应结束后,自动计算出起始DNA的拷贝数。该技术有许多优越性,如无须扩增后分析,避免PCR产物污染,大范围拷贝数的准确定量等。在FQ-PCR反应体系中,荧光标记的探针与模板成功杂交并发出荧光需要一定的离子强度,离子强度太低或太高都不利于荧光探针的成功杂交及发光。荧光探针的酶切发光需要TaqDNA聚合酶的作用,而此酶活性的发挥依赖于游离镁离子的存在,故在此优化方案中分析了镁离子对实验结果的影响。取人体细胞内β-肌动蛋白基因作细胞内参照,同时扩增病毒目的基因片段和内参照,能够提高实验结果的精确性。因人体细胞内β-肌动蛋白基因与病毒基因是同时提取并同条件扩增的,所以检测得到的β-肌动蛋白基因,一方面是对临床标本DNA提取成功与否的监测指标,另一方面CH/Cβ代表HPV16E6DNA量与人β-肌动蛋白DNA量的比,说明患者单位细胞的带病毒量,在一定程度上可以反映病毒在局部复制的活跃程度。96例宫颈脱落细胞标本系2d内随机采自门诊就诊者,绝大多数为阴道炎,其次为宫颈炎,盆腔炎及其他非肿瘤患者,HPV16E6检出率较低(3.3%),代表门诊普通妇女人群中HPV16的感染情况,可作为对照。59例宫颈癌蜡块中HPV16E6阳性49例,阳性率83.0%。李洁等在全国14个省、市、自治区内共检测815例子宫颈癌,HPV总检出率为53.5%,其中HPV16的检出率最高,但仅为31.9%;新疆宫颈癌组织中以HPV16型感染为主,HPV16的阳性率为60%;其结论与本研究基本一致,但本研究样本含量大且HPV16的阳性率更高,考虑为本实验灵敏度较高或针对的人群不同所致。CIN蜡块组织65例中,28例因β-肌动蛋白阴性被剔除,保证了结果的准确性;余37例β-肌动蛋白阳性的CIN中,HPV16E6阳性28例,阳性率75.7%,低于宫颈癌组,而差异无显著意义。本组病例统计分析显示,宫颈癌蜡块组织HPV16E6的相对含量高于CIN及对照脱落细胞组,CIN各组又高于对照脱落细胞组,均P<0.05。HPV16E6的相对含量随病情加重呈上升趋势,二者呈显著正相关,相关系数为0.83。故用FQ-PCR检测宫颈不同病变组织中HPV16E6的相对含量的方法,可应用于宫颈癌的筛查,不同程度癌前病变(CIN)转归的判断,以及治疗后病人愈后判断和放疗的疗效观察,风险评估。新疆地区宫颈癌高发,且维吾尔族患者占绝大多数。本文从分子水平上研究了新疆地区宫颈癌与HPV16E6基因的关系。HPV16E6基因与新疆地区宫颈癌的发病密切相关。值得一提的是宫颈炎的蜡块组织中,HPV16E6阳性率高达93%,与宫颈癌及CIN组差异无显著意义。该组均为