实时荧光定量pcr法检测宫颈疾病血清中mir-21的表达

实时荧光定量pcr法检测宫颈疾病血清中mir-21的表达

mirna是一个非编码的小分子rna，由内源性非编码物质组成，长度约为21.25g钠，5'带磷酸基团和3'带羟基的非编码调节家族组成。其通过与mRNAs结合抑制翻译或造成mRNAs被酶解切割而起到基因调控的作用。目前已发现的miRNA类型约700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测其中人源的miRNA约有200多种。miRNA对疾病的影响、致病机制已成为研究的热点。通过miRNA芯片分析发现,miR-21在乳腺癌、肺癌、食管癌、胰腺癌等组织中表达水平较高。miR-21位于HPV-16整合位点之一,即脆性位点FRA17B区域中。在99.7%宫颈鳞癌和94%~100%的宫颈腺癌及腺鳞癌中都检测到高危型HPV感染,其中HPV-16是最常见的类型。因此,是否能将miR-21作为一个新标志物,通过检测血清中miR-21的表达水平来进行宫颈癌的早期诊断和预后判断,是本研究的主要目的。1材料和方法1.1病例选择选择暨南大学附属第一医院妇产科择期手术的10例宫颈癌患者,年龄34~66岁,平均年龄43岁,病理检查结果为低分化鳞状细胞癌,浅层浸润;10例子宫肌瘤患者,年龄32~56岁,平均年龄40岁,病理检查结果为子宫平滑肌瘤;10例宫颈炎患者,年龄25~55岁,平均年龄37岁,病理检查宫颈呈慢性炎症;2位宫颈鳞癌患者术后,年龄为47岁和48岁。上述研究对象均取外周静脉血3mL,分离血清,置-70℃保存。1.2pcr试验方法Trizol试剂(美国Invitrogen公司);氯仿、无水乙醇、异丙醇和DEPC水(广州达晖公司);miR-21荧光定量PCR试剂盒(上海吉玛公司);逆转录所需的dNTPs及逆转录酶、100bpDNALadderMarker(广州达晖公司);ABIPrismue4f07000荧光定量PCR仪(美国ABI公司);KDC-160HR高速冷冻离心机(中国科技大学中佳公司);ESCO生物安全柜(ESCO公司);Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf公司)。1.3-4-gcctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagct-5-aecgctacgaatttgrt-35555555555555555555555555555-gcctagctagctagctagctagctagctacrtgactctacrtgactagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctacrt-3555555555555555555555555-ctacrtcactacrtcactagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrta,5-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-CACTGGATACGACTCAACA-3′,PCR扩增引物上游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;下游:5′-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′。内参U6反转录引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;PCR扩增引物上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以上引物均由上海吉码公司合成。1.4hp-key检测取患者宫颈脱落细胞用导流杂交法(凯普公司人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒)检测感染HPV基因型。1.5样品国的制备吸取250μL患者血清,加入1mLTrizol试剂,反复吹打裂解细胞,室温静置5~30min。12000×g离心10min,取上清,加入200μL氯仿/mL。剧烈震荡15s至乳胶状,室温静置15min。12000×g,4℃离心10min。另取1个EP管加入500μL异丙醇,将上层水相加入混合均匀,室温静置10min。12000×g,4℃离心10min。弃上清,用0.1%DEPC水配制的75%乙醇混匀。7500×g,4℃离心15min。尽量去除上清液,RNA沉淀空气干燥10~30min,加入20~30μLDEPC水溶解RNA,65℃烤箱10~15min。在260nm和280nm波长下检测吸光度(A)比值,确定RNA的纯度及浓度。1.6逆转录pcr检测n-msv反应体系为20μL,包括5×逆转录缓冲液4μL,dNTP(10mmol/L)0.75μL,miR-21逆转录引物(1μmol/L)1.20μL,M-MLV逆转录酶(200U/μL)0.2μL,总RNA样本5μL,DEPC水8.85μL。反应设1个复孔。反应条件为16℃30min,42℃30min,85℃5min。内参U6逆转录反应参数同上。1.7财聚酶抑制剂taqnat反应体系为20μL,包括2×realtimePCR缓冲液10μL(含SYBRGreenI荧光染料),上、下游引物(5μmol/L)各0.16μL,cDNA模板2μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,DEPC水7.48μL。以同样反应体系和U6特异性引物进行内参U6荧光定量。反应参数:95℃3min;95℃12s、62℃50s,共40个循环。阴性对照以生理盐水代替逆转录产物。设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。以所有标本中miR-21基因Ct值最低的标本作为对照,△Ct=CtmiR-21-CtU6snRNA,△△Ct=△Ct实验标本-△Ct对照标本,miR-21基因相对表达量用2-△△Ct计算。1.8各组患者的表达水平比较用SPSS17.0软件进行。经方差分析发现miR-21基因相对表达量不满足正态分布和方差齐性条件,故以M(P25,P75)表示,用Mann-WhitneyU检验进行组间比较。以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1筛查基因型确定10例宫颈鳞癌患者宫颈刮取物标本HPV筛查基因型为HPV-16型阳性;10例子宫肌瘤患者、10例宫颈炎患者以及2例宫颈原位癌术后患者HPV基因型检查均为阴性。2.2ir-21熔解温度miR-21、U6的熔解曲线峰值单一,略有差异,未见杂峰信号;miR-21熔解温度为81℃,U6熔解温度为83℃。表明PCR参数选择适当,miR-21、U6逆转录引物和扩增引物能够扩增出miR-21、U6片段,产物特异度较好,非特异产物对结果影响较小。2.3mir-21、u6snna检测阴性对照产生的微弱的非特异扩增信号明显滞后于患者血清标本的曲线。患者血清miR-21反应曲线呈标准S型。32份血清样本中的miR-21、U6snRNA检测结果见表1。宫颈癌患者血清中miR-21表达水平明显高于子宫肌瘤(Z=3.781,P<0.05)和宫颈炎患者(Z=3.780,P<0.05)。子宫肌瘤和宫颈炎患者血清中miR-21表达水平无显著差别(Z=0.983,P>0.05)。宫颈癌患者术后血清miR-21表达水平低于宫颈癌术前,但标本量较少无法做统计学分析。3mir-21在临床研究中的应用miRNA分子的序列短小,在基因组中存在较多的互补序列,在不同生物体内与靶标结合的方式也不尽相同,而且还常与多种蛋白质相互作用,因此建立一种有效而且普遍适用的研究方法异常困难。目前常用的检测miRNA的方法有基因芯片、TaqMan探针法、northernblot等。芯片具有高通量性可一次检测多种miRNA,但不稳定,经过芯片筛选出来的miRNA往往需要进一步验证。TaqMan探针法具有特异性高,花费时间短等优点,但成本较高。northernblot是验证和确认miRNA的经典方法,但该法繁琐并且灵敏度低,不适于临床大规模筛查。本研究用价廉的SYBRGreenI荧光定量PCR法检测宫颈癌患者血清miR-21的表达水平,属国内首报。本实验用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈癌患者血清中的miRNA,设计具有茎环结构的逆转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线的分析结果可以看出基本没有引物二聚体的形成,证明了反应的特异性。分析荧光定量的结果发现,宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等