原生质体递归融合技术选育微生物基因组重排

原生质体递归融合技术选育微生物基因组重排

21世纪以来，随着石化资源、能源危机和环境危机的加剧，以生物技术为原料的生物产业呈现出前所未有的竞争力，促进了工业菌株育种技术的发展。传统育种技术工程量巨大,耗时长,且难于获取复杂表型。近十几年里,工业菌株改造主要集中在代谢工程。该技术主要是运用现代基因手段,对微生物进行定向基因操作。虽然代谢工程育种较传统育种取得了一定成果,但是基因型和表型相应背景的欠缺会限制其更广范围的利用。基因组重排技术是一种典型的全面组合技术手段,是全基因组代谢工程的延伸。2002年,Zhang等在Nature上发表文章,首次提出基因组重排技术——结合传统育种技术,通过多亲本之间的DNA重组和全基因组片段交换,将优良表型重组在一起的过程。Zhang等将基因组重排技术运用于改造弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae),极大的提高了其合成泰乐菌素(tylosin)的能力。基因组重排技术具有菌株改造方面的优异表现,被认为是菌株选育和代谢工程上的一个重大里程碑。1基因组重排技术基因组重排技术作为新型的育种技术,基于原生质体融合技术之上,使不同基因组发生重排的过程。其主要机制在于利用原生质体融合达到全基因组片段交换、重组,经过多轮递归融合后促使正向突变表型聚集,与经典诱变育种,原生质体融合相比具有明显的优势(表1)。首先,相较诱变育种、原生质体融合技术等,基因组重排技术具有更高的效率。诱变育种具有盲目性、随机性,导致工程量巨大,时间漫长,菌株突变面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用,但是有性生殖途径只能允许在双亲本之间的基因重组。基因组重排技术基于多亲本之间的递归融合,具有更大基因突变来源;递归融合还能使正向突变的表型聚集,多轮融合极大的提高了基因交换的概率。Zhang等发现两轮的基因组重排取得的成果相当于20年经典育种才能完成。综上,与传统育种相比较,扩大菌株的基因型和加速菌株进化速度是基因组重排技术最大的优势。其次,基因组重排技术可以无需了解相关微生物的代谢途径、关键酶的表达基因、转录调控等知识背景,尤其适合微生物代谢途径的遗传改造。尽管DNA重组技术可以在多亲本之间发生基因重排,但改变的是基因片段而不是整个基因组。微生物细胞的表型受代谢要求,能源利用,环境压力、全基因组水平表达而决定的,所以通过几个特殊基因的定向改造是很难达到菌株表型的优化。而基因组重排技术是全基因组工程策略,在无需知道基因组信息及代谢网络信息情况下,就可以运用于菌株改良。此外,基因组重排技术操作简单,容易推广,不需要昂贵的实验仪器,而且见效快。因此,基因组重排育种很适合工业菌株的改造工程,不仅体现成本经济效应,还具备高效性。2原生质体的制备和诱导基因组重排技术过程主要分为三步:(1)不同亲本原生质体的制备;(2)诱导原生质体递归融合,每轮筛选的目的菌进入下轮融合;(3)根据目的表型需要设计特殊的选择培养基,每轮筛选的融合菌株,进入下轮的融合。2.1般筛选准则亲本菌株基因的多样性可以扩大融合菌的基因型,在递归融合中促使不同优良表型汇集到融合菌中,故基因组重排技术过程的首要任务是创造亲本基因型的多样性。一般手段是传统诱变育种技术,使菌株产生更多的基因型。作为筛选亲本菌株的一般准则是亲本菌株必须具有理想的目的表型,如具备特殊环境高耐受力,产物高产率和菌株高生长率。菌株高生长繁殖率是值得关注的问题,在较高底物及产物浓度等不良环境下,微生物可以通过高生长率来修复。随着研究的深入发展,亲本选择的方式逐渐灵活多样。John等将徳氏乳酸杆菌的诱变株和含分泌淀粉酶的芽孢杆菌进行基因组重排,结果收获了能在木薯渣废液中生长并转化乳酸能力的融合菌。2.2原生质体的诱导基因组重排技术是基于原生质体融合技术之上的多轮递归融合。多轮递归融合确保了不同细胞之间的基因高转移频率,还保持了基因组重排的高效性。在原生质体递归融合过程中,首先要制备原生质体。制备原生质体主要参考的因素有菌龄、酶解浓度、酶解时间及温度、酶的种类、脱壁辅助溶剂的选择和渗透压缓冲剂及再生培养基的设计等。递归融合的要义在于进行第一轮融合后筛选的融合菌株作为出发菌株,必须进入下轮融合。目前,诱导原生质体融合的方式主要有生物病毒法,化学法和电处理融合法。化学法和电处理融合法是当前最主要的方法。随着科学技术的不断发展,一些新的工具开始运用于诱导细胞融合。Gong等用激光诱导红发夫酵母进行细胞融合。Skelley等运用微流体芯片技术作为诱导细胞融合的技术平台,明显提高了融合效率。2.3高耐无氯苯酚的融合菌的分离和鉴定目的融合菌的筛选与分离是整个基因组重排技术流程最为关键的步骤。基因组重排技术提高菌株对环境耐受性,可以方便设计含有高浓度的底物或产物的选择培养基。如Dai等利用基因组重排技术改造Sphingobiumchlorophenolicum提高对底物—五氯苯酚的耐受性,设计的培养基含无氯苯酚浓度依次为0.4mmol/L,3mmol/L,4mmol/L,5mmol/L,结果在含5mmol/L无氯苯酚浓度的选择培养基上获取了3株高耐无氯苯酚的融合菌。筛选高产物的目的菌,经典的方法主要依靠产物的物理和化学性质,如在琼脂培养基上的抑菌圈、透明圈和水解圈。John等利用能直接水解淀粉的乳酸融合菌产生的透明圈的大小筛选目的高产融合菌。此外,添加遗传标记可以作为融合菌株的筛选标志,Dai等用基因组重排技术育种革兰氏阴性细菌室,采用菌体营养缺陷型的遗传标记筛选目的融合子。最近Zhao等提出了灭活原生质体的筛选方法。Hida等研究了产物类似物筛选高产菌株方法,利用羟基柠檬酸的类似物反式环氧乌头酸来筛选融合菌。Chen等采用了96目微孔板的体系上培养产雷帕霉素链霉菌的融合菌,结合酶标仪的方法筛选目的融合菌。3菌种表型优化基因组重排技术充分结合了细胞工程和代谢工程的优势,不仅可以进行菌种表型快速高效优化,还可为不同种类的微生物复杂的代谢和调控网络提供了信息来源。目前,基因组重排技术主要应用于提高微生物代谢产物产率,增强菌株对环境的耐受性以及底物的利用率。3.1基因组重排技术在微生物工业发酵过程中,产物的最终产量和产率直接决定着经济效益。基因组重排的对象是细胞内整套基因组,在许多情况下,参与次级代谢产物生物合成的结构基因在染色体上成簇排列,但控制结构基因表达的调节基因则位于生物合成基因簇外,因此将微生物整套基因组视作一个单元进行基因组重排更适合于微生物次级代谢产物产生菌的遗传改造。2008年,Yu等通过基因组重排技术,对鼠李糖乳酸杆菌经过两轮育种后乳酸产量比野生菌提高了71.4%。在2009年,Jin等研究了Saccharopolysporaspinosa的基因组重排育种工作,经过四轮重排后,筛选到了两株高产多杀菌素的融合菌,生产能力比原始出发菌株提高了201%和436%。3.2耐酸耐碱类型化分离微生物在环境中的耐受力水平是极复杂的表型。环境耐受力的相关特征包括底物的耐受性、产物及副产物的耐受性、温度的耐受性、对pH和溶氧等因素的耐受性。当前,基因组重排技术已经成功应用于提高乳酸杆菌对酸和葡萄糖的耐受性,提高了产普纳霉素的Streptomycespristinaespiralis对普纳霉素的耐受性,还用于提高了酿酒酵母的热耐受性和乙醇的耐受性,获取的融合子可以在55℃下正常生长和能耐受25%(V/V)的乙醇。2007年,Wang等通过对乳酸杆菌的基因组重排育种,经过三轮融合后,筛选到了4株能在pH3.6上生长的耐酸融合菌。2009年,Burkhard等应用基因组重排技术最终筛选到了一株耐甘油和1,3-丙二醇的ClostridiumdiolisDSM融合菌,其1,3-丙二醇产量相较原始菌提高了80%。3.3最佳添加量的确定在菌株改良过程中,底物利用效率和范围也是非常重要的目的表型。基因组重排技术同样适用于提高菌株对底物的利用能力。在2008年,John等利用基因组重排技术,以德氏乳酸杆菌和产淀粉酶的枯草芽孢杆菌为亲本菌株,经过三轮原生质体融合后,筛选到了能直接转化淀粉为乳酸的融合菌,结果表明在83g/L的木薯废水解液中外源简单添加辅助成分后,乳酸产量达40g/L。2004年,Dai和Copley利用基因组重排技术对Sphingobiumchlorophenolicum表型改良,经过三轮基因组重排后,筛选的融合菌比野生菌具有对五氯苯酚的更高利用率和耐受。3.4基于pgtm的重排后代谢分析基因组重排技术另一重要作用可以提供代谢网络和调控的知识。基因组重排技术过程,随着整个基因组片段的重排,从而可以快速达到改进细胞表型或优化代谢途径的目的,同时结合代谢工程中的各种分析工具对重排后所得到的进化产物(酶、代谢途径)进行比较分析,可以更好地阐明优化的原因或本质,Gill等提出的一种高通量的并行基因——表型作图法(parallelgene-traitmapping,PGTM)用于重排后产生的大量嵌合基因组的比较分析,快速确定基因和表型的相关性。2008年,Jin等应用多样性片段扩增技术分析了由基因重排技术获得的重组菌株与原始菌株之间的基因差异性。4针对重组技术的应用和前景4.1表型融合菌筛选的重要环节基因组重排技术应用菌种改良,由于基因组片段重组也是随机的并不具备定向性,如何高效筛选目的表型融合菌存在着一定的困难和挑战。基因组重排技术目前普遍运用于同种双亲细胞内,对于不同种亲本细胞之间的报道还是很少,同源性越差,重组概率越低。4.2工程菌株的构建进程