肠道内添加益生菌对腹腔感染大鼠肠道微生态的影响

肠道内添加益生菌对腹腔感染大鼠肠道微生态的影响

通常，肠道的微生态处于平衡状态。在腹腔感染、休克、创伤等应激状态或大量使用抗生素,长期禁食而使用静脉营养的情况下,可导致肠微生态的破坏,容易出现肠道菌群紊乱,进而细菌易位增加,造成不良后果。而正常的肠道菌群作为一种生物屏障,对减少细菌易位可能有积极作用。为此,我们通过建立腹腔感染大鼠模型,观察补充益生菌对肠道菌群及细菌易位的影响。肠外灌注益生菌实验动物雄性清洁级SD大鼠16只,体质量250～320g,复旦大学上海医学院动物房提供,生产许可证号SCXK(沪)2002-0002,使用许可证号:SYXK(沪)2002-0011,随机分成2组,每组8只。对照组腹腔感染造模成功后,在造模当天给予生理盐水静脉滴注维持,腹腔感染造模后1～5d给予静脉营养支持;实验组腹腔感染造模成功后,静脉营养加用益生菌的肠外营养。两组大鼠于造模成功后第6天处死取样。肠内灌注益生菌益生菌由上海交大昂立股份有限公司生产。其主要成分为嗜酸乳杆菌及其代谢产物,活菌约为108CFU/mL,经空肠造瘘管每天分3次缓慢注入,约10mL/d。培养基和微生物培养方法1.含半胱氨酸的Ringer缓冲液:含有半胱氨酸0.25g的Ringer1片(Oxoid),蒸馏水500mL,121℃15min。2.双歧杆菌培养基(EugonTomato培养基):番茄汁400mL(自制),Eugon琼脂45.4g(BBL),麦芽糖10g,氯化血红素(5mg/mL)1mL(Sigma),琼脂5g(Difco),蒸馏水600mL,pH6.0,118℃15min。3.产气荚膜梭菌培养基(N-N琼脂培养基):BactoPetone40g(Difco),Na2HPO45g,Ka2HPO41g,NaCl2g,MgSO40.1g,葡萄糖2g,Bacto琼脂25g(Difco),蒸馏水1000mL,pH7.6,115℃15min。冷却至45℃,加蛋黄EggYolkEmulsion100mL(Oxoid)、硫酸新霉素(50mg/mL)4mL。4.乳酸杆菌培养基(MRS琼脂培养基):MRSBroth55g(Difco),琼脂15g(Difco),蒸馏水1000mL,121℃15min。冷却至45℃,加入添加剂磷霉素(15.9mg/mL)、磺胺甲氧甲嘧啶(18.6mg/mL)、三甲氧卞氨嘧啶(1mg/mL)各5mL。5.麦康凯平板购自伊华公司;厌氧盒和厌氧产气袋购自生物梅里埃公司;心脑浸出液购自Oxoid公司。肠道菌群厌氧培养取盲肠内粪便0.1g置于9mL含半胱氨酸的Ringer稀释液中,搅拌混匀,并制成浓度分别为10-2、10-4、10-6、10-8g/mL的4种混悬液。各取100μL混悬液分别在麦康凯培养基、EugonTomato培养基、MRS琼脂培养基上均匀涂抹。(36±1)℃孵育24～48h后,观察菌落形态并计数。细菌易位测定取大鼠腔静脉血1mL、肠系膜淋巴组织、肝脏中叶和右肺下叶组织,在匀浆机中匀浆后分别置于心脑浸出液管中,35℃增菌。孵育18～24h后,分别接种于伊红美蓝培养基上,35℃孵育18～24h后测定,易位率=阳性个数/(大鼠个数×4)。细菌定量按照稀释浓度的高低顺序,挑取菌落生长分散的平板,计数菌落数,并乘以稀释倍数。统计学分析利用SPSS10.0forwindows版统计软件进行统计分析,数据采用x±sx±s表示,对各组数据进行χ2检验、t检验及相关分析。结果细菌的鉴定1.形态、革兰染色挑取EugonTomato培养基上的可疑菌落,在相差显微镜下活体观察。形态为多形型,菌体呈直、弯、分叉、球拍状或棒状(X、V、Y型等),革兰染色为阳性杆菌。对可疑菌落采用DadeBehring公司的MicroscanAutoscan-4系统和RA-ID板进一步鉴定(图1)。2.爱酸乳菌挑取MRS琼脂培养基上灰白、中等大小、可疑的菌落,在相差显微镜下活体观察,菌体呈杆状、短链状、栅状,革兰染色为阳性杆菌。3.产气梭菌在N-N琼脂培养基上,菌落周围出现乳白色浑浊圈,为卵磷脂酶分解卵磷脂所致。本菌为革兰阳性粗大杆菌,芽胞位于菌体中央或次极端。4.两组的细菌易位率比较麦康凯平板上生长,菌落湿润,中等大小,革兰染色为阴性杆菌。细菌易位情况对照组大鼠远处及近处脏器的细菌易位率为59.3%,而实验组细菌易位率为34.3%,较对照组明显减少(P<0.05)。肠菌群中各菌种数量实验组大鼠肠道内的正常菌群,除肠杆菌无差异外,双歧杆菌和嗜酸乳杆菌都较对照组的大鼠多,而肠道内的有害菌产气荚膜梭菌较对照组大鼠少,有明显差异(P<0.05)(表1)。益生菌对肠道菌群的影响人体正常肠道菌群含有400～500种不同类型的细菌,在这种情况下,宿主与细菌之间借助对营养物质的吸收和利用,在消化道形成诸多相互作用的关系,维持着消化道的平衡。在某些病理情况下,随着这种平衡被打破,肠道内的细菌可出现在肠外组织,如大网膜、肠系膜淋巴结、门静脉、肺等其他组织,这一过程称为细菌易位。肠道是重症感染病原菌的储库,在正常情况下,各菌群经常会有少量的细菌向周围发生横向或纵向转移,但由于数量少,以及各菌库原生境的原籍菌的生物拮抗作用和宿主的免疫机制,尽管会经常发生,但不会转移成功。在腹腔感染时,因抗生素的大量使用及长期禁食,可导致肠微生态破坏,机体免疫力降低,肠道动力下降,条件致病菌过度繁殖,在肠黏膜上皮定植,细菌移位增加,肠屏障受到破坏,转移菌数量过大,移位就成为可能。所以肠道内维持内环境稳态,保护机体免受病原微生物入侵显得尤为重要。目前认为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌是人体有益生理菌,因能与肠上皮细胞和谐共生,被视为人体肠道健康卫士,其重要性已得到重视。本研究对腹腔感染大鼠模型分别实施肠外营养和加用益生菌的肠外营养,观察它们对肠道菌群改变、细菌易位的影响。在实验中我们可以看到,给予加用益生菌的肠外营养后,大鼠死亡率以及血、肠系膜淋巴组织、肝和肺的细菌易位率都明显低于对照组。粪便厌氧培养发现,实验组大鼠除肠杆菌没有明显增加外,乳酸杆菌和双歧杆菌在数量上都明显高于对照组(P<0.05);而潜在致病菌中产气荚膜梭菌明显减少(P<0.05)。对照组明显引起了肠道菌群紊乱,致病菌增加;而加入益生菌后,增加了有益菌的含量,降低了致病菌的数量。提示益生菌能调节肠道菌群微生态平衡,保护肠屏障功能,减少肠道细菌易位。取样的时间和方法对结果有重要影响。由于双歧杆菌属于专性厌氧菌,对氧的耐受性差,所以及时接种