番木瓜组织培养与环斑病毒病的抗性研究

番木瓜组织培养与环斑病毒病的抗性研究

番木瓜的植株复杂，遗传高度混合。很难通过传统的育种方法保持相同的植株性。同时，番木瓜环境病病从多年生持续到一级，极大地限制了番木瓜的生产和利用。通过组织培养进行无性系快速繁殖可以解决,在种苗商业化生产中已进入应用阶段。1材料和方法1.1外植体的选择、检测和预处理从田间成年健壮番木瓜植株上剪取生长有顶芽和侧芽的旺盛分枝,切除多余枝条部分,去掉叶片、叶柄,放入保鲜袋。1.2消毒外植体的决定1.2.1山农政监狱培养的筛选自来水冲洗10min→饱和肥皂水浸泡20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗2次→4%次氯酸钠12min→无菌水冲洗4次→消毒的滤纸上吸干水分→接种到不含山农一号溶液的培养基中。1.2.2山农政民间培养基的制备自来水冲洗10min→饱和肥皂水20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞10min→4%次氯酸钠8min→无菌水冲洗4次→消毒的滤纸上吸干水分→接种到不含山农一号溶液的培养基中。1.2.3接种水生物膜的制备自来水冲洗10min→饱和肥皂水20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞10min→无菌水冲洗4次→消毒的滤纸上吸干水分→接种到不含山农一号溶液的培养基中。1.2.4山农政药种的制备自来水冲洗10min→饱和肥皂水20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗3次→0.1%升汞10min→4%NaClO8min→无菌水冲洗4次→接种至含有0.2%山农一号溶液的培养基中。1.2.5接种及接种方法自来水冲洗10min→饱和肥皂水20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗3次→0.1%升汞10min→无菌水冲洗4次→接种至含有0.2%山农一号溶液的培养基中。1.2.6接种及接种方法自来水冲洗10min→饱和肥皂水20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗3次→4%NaClO8min→无菌水冲洗4次→接种至含有0.2%山农一号溶液的培养基中。1.3培养基诱导培养基:MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂。1.4培训条件培养室温度25±2℃,光强1500lx,光周期12h,相对湿度60-80%。1.5材料的冲洗和接种供试材料“穗优”细菌污染材料10瓶,每瓶1个外植体。先用无菌水冲洗材料,后用细头尖镊剔除粘附在外植体表面的细菌(物理清除),再用25mg/L的硫酸链霉素溶液(孔径0.22μm的滤膜抽滤)浸泡清洗,最后将材料接种至含0.2%山农一号的培养基中。2结果2.1综合考虑消毒处理效果由表1可知:方法I、Ⅲ有较高的污染率,而Ⅱ与IV、V有较高的失活率;综合考虑方法Ⅵ消毒处理效果较好,污染率11.11%,成活率77.78%。消毒后顶芽与侧芽接种在MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基上,4-6周后形成小丛芽,没有明显的愈伤组织(图1)。2.2外植体的拯救试验使用浓度25mg/L、经抽滤灭菌(0.22μm滤孔)的硫酸链霉素对10瓶细菌污染外植体(图1-e)进行抢救,之后接种到含有0.2%“山农一号”的培养基上。试验结果显示8株外植体抢救成活,抢救成活率达80%,但对中、重度污染材料无能为力。因此,使用抗生素硫酸链霉素和抑菌剂山农一号结合,对轻度细菌污染的珍贵外植体材料抢救十分有效。3硫酸链霉素pcr外植体的消毒处理试验结果表明番木瓜无菌培养体系的建立可用顶芽与侧芽为外植体诱导丛芽,消毒方法为:自来水冲洗10min→饱和肥皂水浸泡20min→无菌水冲洗3次→75%酒精30s→无菌水冲洗3次→4%NaClO8min→无菌水冲洗4次→接种至含有0.2%山农一号I型溶液的培养基(MS+0.5mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂)。硫酸链霉素对于污染珍贵材料的抢救有较好的效果。研究发现:可用成年植株主茎上带顶芽和腋芽的枝条为材料,留用顶端部分做外植体。切除大叶柄,保留苗端和少数小(直径1-2mm)叶柄。带有腋芽的小叶柄切除基部后和苗端一起消毒,接种在含有BA与NAA的MS培养基上,叶柄腋部形成小植株,同样可以分化成苗。开放式组织培养包括无菌体系的建立,在番木瓜上目前还没有试用。本试验采用传统消毒方法并在培养基内添加一定浓度“山农一号”,污染率大大下降(方法VI)。笔者还尝试了浸泡一定浓度“山农一号”、以及常规消毒与浸泡“山农一号”相结合的四种处理,结果表明,常规消毒与8%的山农一号I型溶液浸泡10-20min相结合