宫颈组织中cdh1和pax1基因甲基化检测

宫颈组织中cdh1和pax1基因甲基化检测

宫颈是妇科肿瘤的一种常见类型，严重危害女性的生活和健康。近来研究发现,多种抑癌基因的失活是导致宫颈癌发生的重要因素之一,而DNA甲基化作为一种主要导致抑癌基因失活的形式在宫颈癌中也较为多见。已有研究表明,上皮型钙黏附素(E-cadherin)的编码基因CDH1异常甲基化与多种肿瘤的发生密切相关。目前对于配对盒家族PAX基因甲基化的研究才刚刚起步且报道较少,而目前国内外有关CDH1和PAX1基因同时在子宫颈癌中的甲基化研究尚未见报道。本研究选择CDH1和PAX1这2个基因,分析其在子宫颈癌发生、发展中的甲基化状态及其与临床病理之间的关系,以期为临床诊断子宫颈癌提供一种新的检测方法。1材料和方法1.1患者性别、年龄2006年1月—2008年11月在上海市第八人民医院接受宫颈环形电刀切除术、子宫全切除术及子宫颈活检的患者。根据宫颈上皮有无异型细胞、异型细胞侵犯上皮程度、细胞极性及核分裂象,获得人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染正常宫颈组织标本15例、宫颈炎组织标本15例、宫颈上皮内瘤样病变(cervicalintraepithe-lialneoplasia,CIN)Ⅰ组织标本15例、CINⅡ～Ⅲ组织标本15例以及宫颈癌组织标本40例。患者年龄17～63岁,中位年龄32岁。对所有样本,均一次性取50～150mg组织,放入液氮中保存以备提取基因组DNA。1.2总dna提取在组织标本中加入组织消化液和蛋白酶K(终质量浓度为0.5mg/mL),55℃消化过夜;取和消化样品等体积的酚、氯仿和异戊醇混合物,室温下振荡、离心取上清液2次;加入1/10体积的3mol/L醋酸钠以及2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,置于-20℃过夜;离心10min,75%的乙醇溶液洗涤沉淀,ddH2O50μL溶解沉淀,置于-20℃保存备用。1.3pcr扩增聚合酶和dNTPmix(混合脱氧核苷三磷酸)均为TaKaRa公司产品,参照试剂说明进行操作。使用MJ公司的PCR仪进行扩增,所有基因甲基化和非甲基化PCR反应条件为:94℃预变性5min,然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s,共35个循环,最后72℃再延伸7min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,溴化乙锭染色。PCR反应体系中,用ddH2O代替DNA作为阴性对照,其余反应试剂和条件均一样。采用PCR产物条带用凝胶成像系统(Bio-Rad公司)进行分析。MSP引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列见表1。1.4甲基化分析基因甲基化总阳性率=基因甲基化总例数/基因分析总例数×100%;基因甲基化率=基因甲基化数/总标本数×100%。1.5统计分析应用SPSS11.5软件进行统计学分析,采用χ2检验和t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2cdh1基因甲基化比例与pv感染正常妊娠和妊娠合并心脏病组织间的相关性表1部分CDH1基因的甲基化和非甲基化PCR产物电泳鉴定结果见图1A。HPV感染的正常宫颈组织、宫颈炎组织和CINⅠ组织中未检出CDH1基因甲基化;CINⅡ～Ⅲ组织中检出CDH1基因甲基化2例(13.3%),与HPV感染的正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组织中检出CDH1基因甲基化9例(22.5%),与HPV感染的正常宫颈组织比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组织与CINⅡ～Ⅲ组织相比,差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见,CDH1基因甲基化比例随HPV感染正常宫颈组织、宫颈炎组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织呈现递增趋势。使用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增的结果显示,在各组样本中用CDH1基因非甲基化引物均能扩增出条带,说明CDH1基因即使在标本中存在甲基化现象,也不是整个基因发生完全甲基化(表2)。部分PAX1基因的甲基化和非甲基化PCR产物电泳结果见图1B。HPV感染的正常宫颈组织和宫颈炎组织中未检出PAX1基因甲基化;CINⅠ组织中检出PAX1基因甲基化2例(13.3%),与HPV感染正常宫颈组织比较差异无统计学意义(P>0.05);CINⅡ～Ⅲ组织中检出PAX1基因甲基化7例(46.7%),与CINⅠ组织比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组织中检出PAX1基因甲基化35例(87.5%),与CINⅡ～Ⅲ组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见,PAX1基因甲基化比例随HPV感染正常宫颈组织、宫颈炎组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织呈现递增趋势。CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织有非常高的PAX1基因甲基化阳性率(表2)。从甲基化总阳性率(任何一个基因出现甲基化即为阳性)来看,HPV感染正常宫颈组织和宫颈炎组织无CDH1和PAX1基因甲基化;CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织的CDH1和PAX1基因甲基化总阳性率分别为13.3%、60.0%和97.5%(表2)。3pax1基因甲基化分布情况大量研究表明,抑癌基因DNA频繁甲基化与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。尽管高危型HPV感染被认为是最有可能的宫颈癌致病因素,但HPV病毒感染本身并不能完全导致宫颈癌的发生,目前所知HPV感染后可启动宫颈癌中相关抑癌基因的失活。CDH1和PAX1是2个较为常见的抑癌基因,本研究对宫颈癌组织中这2个基因甲基化状态进行了检测,探讨抑癌基因甲基化对子宫颈癌发生和发展的意义。Lai等首次发现PAX1基因在宫颈癌中出现甲基化异常,PAX1基因在宫颈癌组织中甲基化异常频率可高达94.5%;PAX1基因甲基化结合HPV检测可显著提高临床检测灵敏度(提高14%),揭示了PAX1基因在宫颈癌的早期发现中具有重要作用。因此本研究通过扩大检测范围,包括宫颈癌发生和发展过程中不同阶段的病变过程中PAX1基因启动子区甲基化分布情况,结果发现PAX1基因甲基化比例随病变过程呈现升高趋势;HPV感染正常宫颈组织、宫颈炎组织和CINⅠ组织PAX1基因无甲基化或甲基化阳性率极低;CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织的PAX1基因甲基化阳性率较高(46.7%和87.5%),远远高于其他大多数基因在子宫颈癌中的甲基化阳性率。同时,这一结果正说明了PAX1基因可以作为宫颈癌临床诊断中极具参考价值的一项指标。E-cadherin的编码基因CDH1是一种肿瘤抑制基因和肿瘤转移抑制基因。在正常组织细胞向肿瘤细胞转化的过程中,CDH1基因失活,细胞黏附能力下降而迁移运动能力增强,因此CDH1基因可作为判断肿瘤从良性向恶性转变的重要分子标志物之一。CDH1基因甲基化现象频繁出现于胆管癌、卵巢癌和胃癌等各种不同的癌标本及肿瘤细胞株中,该基因甲基化可能是导致E-cadherin表达下调或无表达的主要原因之一。本研究结果显示CDH1在宫颈癌中的甲基化率为22.5%,与以往报道相似。本研究首次对子宫颈癌组织中PAX1和CDH1这2个基因同时进行了甲基化研究,检测了这2个基因在宫颈癌发生和发展阶段中甲基化状态的改变。本研究结果显示,PAX1和CDH1基因在宫颈癌组织中的甲基化总阳