苍耳提取物的抑菌活性成分分析

苍耳提取物的抑菌活性成分分析

植物源农药是利用植物根、茎、叶等组织中的植物病原体和昆虫活性物质，通过提取、分离和提取而成的制剂，用于预防和处理植物疾病、昆虫和草地灾害。这是生物合理农药的重要组成部分。由于其高效、低毒、低残留、高选择性和高成本，因此很难考虑其抗逆性。苍耳(XanthiumsibiricumPatr.exWidd),属菊科(Compositae)、苍耳属(XanthiumL),又称野茄、卷耳、爵耳、猪耳、苍子、苍耳子、缣丝草、狗耳朵草等,苍耳全草有毒,幼苗、嫩芽、种子的毒性最大.苍耳在我国分布很广,尤其是在我国北方,资源丰富,常为农业生产中的防除对象.因此,对其进行合理开发利用,可以变废为宝.但是,迄今为止,苍耳在农药方面的研究主要是抑菌活性的初步测定.甘肃农业大学草业学院农药实验室经过多年研究,将苍耳提取物的抑菌成分初步分离得到苍耳提取物Ⅱ,本文拟对所获得的苍耳提取物Ⅱ进行进一步分离纯化并鉴定,以期找到活性物质的纯品和近纯品,为植物农药资源的开发利用奠定基础.1材料和方法1.1试验材料1.1.1苍耳部分提取液苍耳经丙酮回流提取,经过柱层析获得分离后按Rf值将其分割成4部分,其中活性高的第Ⅱ部分提取液,即为苍耳提取液Ⅱ.(由甘肃农业大学草业学院农药实验室提供).1.1.2umschl.黄瓜黑星病菌黄瓜枯萎病菌(FusariumoxysporiumSchl.)、黄瓜黑星病菌(CladosporiumcucumerinumEll.etArthur)均由甘肃农业大学草业学院农药实验室提供.1.1.3仪器、试剂和仪器仪器:真空泵、旋转蒸发仪、光照培养箱、超净工作台、层析柱(3cm×40cm)、气相色谱-质谱联用仪(GC6890N/MSD5973N)等.试剂:葡萄糖、蔗糖、琼脂(天津光复化工研究所)、硅胶GF254(青岛海洋化工厂)、层析硅胶(青岛海洋化工厂,200-300目).溶剂:石油醚、丙酮、氯仿、甲醇(均为分析纯,天津光复化工研究所).1.2测试方法1.2.1形态分离和一级和二级柱层析分离选用规格3cm×40cm的玻璃管柱,以层析硅胶为固定相,用湿法装柱.采用体积比30∶2的丙酮-氯仿混合溶剂为洗脱液,依次进行梯度淋洗,洗脱液流速为3～4滴/s,每流分收集15～20mL,得到30-50个流分,最后用甲醇把所有物质洗出.为了保证能得到比较纯的有效成分,对苍耳提取物Ⅱ进行了一级和二级柱层析分离.1.2.2菌落直径测定在室温下,将各流分置于真空干燥箱中减压浓缩至干,用丙酮定容后采用生长速率法测定各流分的抑菌活性,筛选出抑菌活性较高的流分.活性测定采用含毒介质培养法,在无菌条件下,将1mL不同流分提取液加入到49mL培养基中,摇匀,趁热均匀倒入3个90mm培养皿中,制成含毒培养基平板,平板凝固后接入生长一致的菌饼(Φ=5.0mm).恒温(25±1)℃下培养,用十字交叉法定期测量供试真菌菌落直径,直至对照长满皿.计算菌丝生长抑制率.菌落直径(mm)=测量菌落直径平均值-5.0抑制率(%)=对照菌落直径−处理菌落直径对照菌落直径(%)=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径数据利用DPS软件进行Duncan`s统计分析.1.2.3gc-ms-hp-5分析将高活性流分中的溶剂于室温下挥发至干,经BF3-CH3-OH甲酯化处理为进样液,进行气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析.测试条件:GC汽化室温度250℃;美国J&W.HP-5弹性石英毛细管柱,规格为30m×0.25mm×0.25um;载气为99.999%高纯氦.色谱条件:80℃(3min)～290℃(30min),括号中为保温时间,升温速度4℃/min.质谱条件:EI源,离子源温度230℃,电子能量70eV;谱库NIST02L.2结果与分析2.11对于不同时期的所有过程，对次过渡剂的活性分析都进行了分析2.1.1柱层析分离的效果苍耳提取物Ⅱ各流分对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性见表1,流分3和流分4的活性接近于苍耳提取物Ⅱ.流分2、流分3、流分4和流分5的最高抑制率分别为48.89%、96.79%、83.95%和43.25%,其他各流分活性均小于30%.由此可见,柱层析分离后对黄瓜枯萎病菌有抑菌活性的成分主要集中在流分2,3,4,5.各时间段差异不显著.2.1.2柱层析分离的效果苍耳提取物Ⅱ各流分对黄瓜黑星病菌的抑菌活性见表2,流分3和流分4的活性最高,但比苍耳提取物Ⅱ低,说明有物质丢失.流分3、流分4、流分5和流分30的最高抑制率分别为84.80%、61.74%、28.20%和32.21%.其他各流分活性均小于25%,且大部分小于10%.即柱层析分离后对黄瓜黑星病菌有抑菌活性的成分主要集中在流分3,4,5,30中,但苍耳提取物Ⅱ的抑制率达100%.各时间段差异不显著.2.22不同时期内的高活性次体流的抗菌活性分析2.2.1流分2活性的比较由表3可见苍耳提取物Ⅱ2次过柱各流分对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性.抑制率较高的流分主要集中在2,3,4,5之间,且以流分2活性最高,抑制率达到38.25%,其次是流分3,4,5,6,24,它们的抑菌率分别为37.79%,34.21%,27.12%,22.67%,17.79%.各流分抑菌作用在72h与96h时间段上的差异不是很明显,但与120h的差异则比较明显,并且抑制作用比1次过柱的流分要低,可能是对枯萎病菌产生抑制作用的物质有流失.2.2.2抑制率较高的流分由表4可知,苍耳提取物Ⅱ2次过柱各流分对黄瓜黑星病菌的抑菌活性.抑制率较高的流分主要集中在2,3,4,5之间,以流分3活性最高,达49.12%,其次是流分6,7,8,10.抑菌作用随时间变化有较大起伏,主要表现在高活性的流分2,3,4中,其它流分并不明显.2.3树条提取物活性成分混合物抑菌效果测定由GC-MS检测结果可知,苍耳素Ⅱ含有至少39种以上及未知物质,以油酸类物质为主,其中棕榈酸占31.28%,十八烷酸占26.41%.棕榈酸(十八烷酸未做生物测定)对黄瓜枯萎病菌和黑星病菌抑制率分别为31.80%和16.78%(表5).棕榈酸对枯萎病菌的抑制作用接近于苍耳提取物Ⅱ提取液2次柱层析流分3(活性成分混合物),但低于1次柱层析流分3(活性成分混合物),说明天然植物的有效抑菌成分的混合物较单一物质的活性高.3gc-ms检测试验结果表明,苍耳提取物Ⅱ经柱层析分离后抑菌成分主要集中在流分2,3,4,5中,其抑制率均高于30%.2次分离的流分2,3,4对2种病菌均有很高的抑菌活性,流分2对黄瓜枯萎病菌有较高的抑菌活性,而流分3对黑星病菌的抑制率较高.通过GC-MS检测到的棕榈酸物质,也是在流分2中的相对含量最高,对黄瓜枯萎病菌有一定的抑制作用.由于试验是在农药实验室完成,而植物源农药对环境条件(温