肾阳虚证动物模型的20类造模方法

肾阳虚证动物模型的20类造模方法

有许多关于肾阳虚模型建模的报告。然而，由于模型的选择存在争议，大多数模型无法被认可并应用于实践，因此有必要对之前的模型进行回顾，并详细介绍所有含有激素a-3（包括药物和手术）、羟基磷酰胺、环磷酰胺和其他传统病因的模型文献。一些（雄性）绵羊模型和环磷酰胺模型的文献，如大黄、人参叶、利血平等。一些研究将其归类为肾阳虚的研究范畴。造模动物的理化指标张氏、楚氏、杜氏都曾作类似综述。据文献报道,经过造模方法处理的动物一般会出现体重下降,活动减少,反应迟钝,弓背蜷缩,喜扎堆,畏寒喜暖;体毛枯疏,失去光泽,竖毛,阴囊皱缩,睾丸回升;肛周污染;采食量、饮水量减少等一系列“肾阳虚”证候;造模动物的死亡率升高。这些表现在叙述中不再重复。1糖质醇含量的变化在建立人工高血糖家犬模型时,发现动物血浆内cAMP与cGMP含量及比值的变化类似于肌注氢化可的松小鼠所致的“肾阳虚”模型的变化,血浆皮质醇含量也下降,因而认为用人工高血糖的方法亦可造成“因阴盛而致阳虚”的模型。外源性的血糖升高使糖皮质激素分泌减少,环核苷酸系统功能处于抑制状态。然而这种模型从做模到测定时间不超过4d。受试动物处于非正常生理状态。单纯以环核苷酸系统短时间内的变化以确定其为阳虚模型显然是站不住脚的。而且其他皮质激素类模型都表现出血糖含量下降的变化,与本模型的变化相反。应该注意这一指标的差异对阳虚证诊断是否存在特殊的意义。2组织病理学和病理用灌胃或口服氨基导眠能方法造成的模型具有肾上腺重量减轻,肾上腺皮质萎缩,血浆皮质醇减少,肾上腺组织cAMP水平降低等变化。模型卵巢、子宫内膜存在形态学改变。血浆β-内啡肽含量下降。该模型存在胃粘膜及其腺体的病理改变。胃粘膜中亦存在cAMP/cGMP比值的下降。这种模型由邝氏始创,但没有得到广泛的应用。3肾阳虚证和双补药的模型是否应在临床上模拟采用频繁交配或配合强迫游泳甚至配合腹腔注射苯丙酸诺龙造成的模型,肾上腺、胸腺、睾丸等器官萎缩,其睾丸LDH活性下降,参与精子形成的LDH-X同工酶相对活性亦下降。该模型同时有血睾酮、皮质醇减少,交配生育能力下降,耐力下降。结合外观症状表现和方药金匮肾气丸的反证,可以认为能够较好地模拟中医“房劳-疲劳以致肾虚”的病理状态。然而用阴阳双补药亦可使该模型的症状得到纠正,因此尚需排除肾气或肾阴虚证。雌二醇以雄鼠肌注雌二醇的方法造成另一种肾虚模型,用以模拟临床上老年男性雌雄激素改变的趋势。检测指标和方法与上一模型一致,结果亦大体相近。作者的研究结论亦倾向于将其解释为肾阳虚证,两种模型之间尚存在同样的问题并有待解决,需要把这两种模型的雌雄激素比值作一对比,亦需要与其他肾虚模型进行对比,以合理解释两种肾虚形成的机理及其异同。可以认为,这两种是较为有效的肾虚性功能障碍模型,但其肾阳虚的机理待定。5肾阳虚模型动物用持续低温受冻的方法造成阳虚寒凝血瘀的模型表现为血小板数量、凝血酶功能、凝血机制的改变,以及舌肺肝肾等器官的病理改变。“符合弥漫性血管内凝血表现”。尽管该模型动物在畏寒症状上有典型的体现,然而这种造模方法与人工高血糖模型存在相似的缺点。该模型的阳虚是广泛的全身性的阳虚,还兼夹有寒凝血瘀证,因此不是有效的肾阳虚模型。皮质激素模型血小板的改变与该模型相似,凝血酶的改变则相反。6生精功能损害雷公藤多甙系雷公藤的生物碱,是免疫抑制药物,对睾丸组织直接引起损害,用喂饲含该药物饲料的方法,药物直接作用于精子细胞和精母细胞,能引起睾丸生精功能的损害和病理改变,出现血浆雌激素含量上升及雄激素下降的改变。温肾阳的药物可以纠正这种病理改变。7肾阳虚的不育症模型用喂饲含腺嘌呤饲料或药物的方法可以造成睾丸功能损害的肾阳虚模型。该模型有雌雄激素比例的改变,皮质醇含量下降,血浆促性腺激素含量下降,睾丸在性激素生成功能障碍的同时,又存在精子形成功能的障碍,睾丸内参与代谢的酶及参与精子形成过程的酶活性下降,生精功能低下,睾丸发生组织病理改变。该模型同时还有慢性肾衰表现,包括肾小管组织代谢酶活性的下降,粘多糖含量减少,肾组织病理改变,肾吸收及排泄蛋白氮功能的下降,血浆中分子物质含量增加等。结合模型的外观症状及右归丸的反证,作者认为这是一种肾阳虚的不育症模型。该模型的血浆雌激素含量上升(尽管T/E下降),T3与T4没有显著性改变,作者将血浆cAMP含量的升高归结为造模用药增加了体内合成cAMP的原料的含量使模型没有呈现出与其他阳虚模型一样的cAMP/cGMP含量的改变。8脑干听诱发电位阈值的变化庆大霉素具有耳毒性和肾毒性,该模型除肾排泄蛋白氮功能障碍外,还有听力的下降,表现为脑干听觉诱发电位阈值的升高,有内耳组织和肾组织的病理改变。作者还观察了模型体温下降、耗氧减少、耐力下降等表现。雷公藤多甙、腺嘌呤、庆大霉素三种模型都以药物对器官直接造成损害,形成相应的病理,并根据外观辨证和药物反证,确定其为肾阳虚模型。9生物特征以猫哧鼠的方法造成的“恐伤肾”模型具有血浆中分子物质含量升高、巯基含量下降的表现。模型子代鼠的活动能力与摄食水平都低于正常组。日本学者曾应用类似方法,培育出乙酰胆碱反应高的虚寒型和反应低的虚热型鼠。冯氏与王氏等为肾阳虚证实验研究的动物模型制作创作了一种新的方法。10d细胞基因突变根据临床观察所得,用喂养缺铁饲料的方法造模,按照外观症状辨证标准分为肾虚、脾虚的两种证。缺铁使模型血红蛋白含量下降,红细胞细胞膜转运功能降低,表现为丙酮酸氯离子交换速率常数下降,膜蛋白电泳带3与4比值下降,耳蜗细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、过氧化物酶等含铁酶活性下降,内耳听力下降,表现为脑听觉诱发电位阈值上升,耳蜗组织显微结构改变等表现。该模型血中和内耳铁、镁离子含量下降,铜、锌离子含量无显著变化。作者并无明确属于何种肾虚的模型,但作者发现辨证为脾虚动物上述表现的程度要轻于辨证为肾虚的动物,甚至未出现扫描电镜下听毛细胞静纤毛的病变特征。11两种饲料的共同添加量大鼠睾丸中皮质醇的情况,未改变模型模型的基以烧烙背部皮肤造成“急病及肾”动物模型。该模型有明显的睾丸糖元含量减少,间质细胞和腺垂体促性腺激素细胞的病理变化,肾上腺皮质、睾丸和腺垂体DNA含量无明显差异,模型血浆睾酮和皮质醇含量均下降。作者以补阳和补阴两种饲料进行“食疗”,均能纠正模型的上述改变,文章无提供可供区别模型证候的资料,因此该模型是阴虚抑或是阳虚,有待讨论。食疗该模型血浆内睾酮和皮质醇的的含量远高于正常对照组,因此该模型诊断为肾虚的依据亦需再进行讨论12氢可模型与肾阳虚证以锁阳水提物灌胃,或者配合肌注氢化可的松造模源出于作者在检验中药锁阳的补阳功效的过程中,发现锁阳鼠在某些指标上的变化比氢可模型更接近阳虚,包括血睾酮含量、皮质醇含量减少,睾丸、胸腺重量下降等,锁阳模型亦有睾丸、包皮腺的组织病理改变。在作者进行的相关研究中,氢可模型的血浆睾酮含量有上升趋向,但变化不显著,这一结果与其他文献的报道不相符。氢可模型耳廓微循环的瘀滞改变不能为锁阳所纠正。尽管以上资料并不足以证明锁阳模型属肾阳虚证,但作者认为氢可模型“不能满意地模拟以性功能低下为主要特征的肾阳虚有关辨证标准”的观点值得注意。另外,在吴氏的实验中亦提到——淫羊藿提取物合AHP大鼠模型“明显消瘦,体重下降……”黄芪、白术复方可使淫羊藿的这种抑制生长发育的不良反应得到很好改善。这一补阳中药加重氢可模型症状的现象应该引起重视。13温阳药和补气药对大鼠脑神经再生模型的影响以灌喂石膏知母煎剂造成的模型具有肾上腺内皮质醇含量下降,脑内去甲肾上腺素、多巴胺、5羟色胺含量和血浆多巴胺羟化酶含量下降的表现,作者比较了温阳药和补气药对该模型的影响,将该模型定义为“虚寒证”。14方外结论及应用环磷酰胺模型的中医辨证仍有分歧。在为广泛接受的陈奇著作中,环磷酰胺动物被作为一种脾虚模型使用。中药补脾四君子汤等可以使模型动物的免疫受抑情况得到改善。而从实验结果来看,环磷酰胺模型的中医辨证的确需要斟酌。例如最近的王氏、张氏的报道,他们对比了不同剂量的环磷酰胺对动物的影响,并对比四君汤和六味地黄汤对某一“合适”剂量环磷酰胺模型的疗效。结果认为,环磷酰胺模型至少是气(阳)虚证;而李氏等发现以补肾阳药为主的复方葆春丸对环磷酰胺模型的疗效比以补脾药为主的四君汤要好。因此,尽管环磷酰胺动物具有肾阳虚证的一些症状表现,现在就对其下结论是不合适的。而且环磷酰胺模型的实验主要用于肿瘤治疗研究,文献相当丰富。还有大量的未曾涉猎的外文资料,因此在目前条件下作出任何肯定的结论并无多大意义。本文所选的内容仅可作为与其他模型进行对比的资料[33,34,35,36,37,38,39,40,41]。各种环磷酰胺模型的报道却引起我们的思考陈小野等认为中医证候模型,需要有该证代表方剂的治疗有效的作为反证。但这里,不同的方剂均可对环磷酰胺模型治疗有效,不同的实验对环磷酰胺模型有不同的辨证。看来,陈氏的结论并不完全与实际相符。15睾丸模型的是否为虚而不为实(雌雄)去势造模亦被应用于对骨质疏松及更年期综合症研究的实验中,因此以“阳虚”或“肾阳虚”作关键词并不能检索到全部以去势方法造模的文献。而且这些文献以报道骨组织形态及计量指标为主,与本文所关注肾阳虚研究范围有差距。因此本文对该模型的归纳并不能包括那些不以“阳虚”或“肾阳虚”标引的文献。在所掌握的资料中,睾丸模型有提肛肌、包皮腺、前列腺-精液腺重量下降,阴茎勃起时间延长,持续时间缩短等生殖系统的衰退表现外,还有耐力下降、耗氧减少、体温下降等。该模型血浆促黄体素、促卵泡激素含量上升,雌二醇与睾酮含量下降,T/E下降。卵巢切除模型下丘脑、垂体、血中的B内啡肽含量和下丘脑亮氨酸脑啡肽含量均下降,子宫重量下降,红细胞Ca-Mg-ATP酶、Mg-ATP酶、蛋白激酶C等含量下降,骨组织内钙、锰、铜、锌、镁等含量下降。大多数文献并不将(雌雄)去势动物当作阳虚模型进行运用。事实上,尽管睾丸全切动物体内雌雄激素的含量表现出与其他某些阳虚模型相类似的变化趋向,然而单纯以去除内生殖器官的方法所模拟的肾阳虚显然是片面的。去势不是肾阳虚造模的适合方法[42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53]。16阳虚证的切除以肾上腺全切法造成的模型使卵巢重量下降,雌激素受体解离常数上升;舌组织表现为营养及代谢降低的病理变化与甲基硫氧嘧啶阳虚动物的表现一致。然而这种方法造模的报道很少,估计原因为切除肾上腺对模型动物伤害太大,使该方法难以开展。另外,阳虚证需要有肾上腺皮质功能抑制表现,但机体中仍然存在着下丘脑——垂体——肾上腺皮质轴的反馈,切除肾上腺的方法切断了这一反馈的途径,与临床实际相距太远。这可能也是一个原因。17模型血浆内皮质醇和酮皮质的含量变化较多的文献选用兔作为甲状腺全切模型动物,体形较大的兔易于进行手术操作估计是一个重要原因。有4篇文献报道了该模型环核苷酸及其比例的变化,各篇报道结果不一致甲切模型下丘脑内5羟色胺、5羟吲哚乙酸无显著变化。交感——肾上腺髓质系统的多巴胺递质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等的含量显著增加。肾上腺髓质及尿液中儿茶酚胺含量增加。模型肾上腺VitC含量上升。同一研究者在不同的实验中报道该模型血浆内皮质醇含量的不同结果,一件为含量自身前后对照,甲切组差值比正常组差值显著增高,一件为甲切组与正常组皮质酮含量无显著改变。到底这是模型兔体内醇和酮皮质激素的差别,还是提示甲切模型不存在肾上腺皮质激素的变化,还是实验误差,有待进一步发掘。由于分泌甲状腺素的器官被切除,模型血中T3与T4含量均下降。其程度要甚于药物甲减模型。组化检测发现模型肝细胞内RNA含量显著增加,DNA含量,ATP酶、5核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶、糖元活性无差异,胰岛B细胞分泌颗粒含量下降。肝、胰、脾、胸腺、舌尖等存在不同程度的组织病理改变。模型血清促甲腺素增加,下丘脑促甲腺素减少,垂体重量增加,卵巢重量减少。模型的体温,无论是肢温或肛温都比正常组要低。文献报道了该模型接受“风寒风热刺激”后体温的变化结果。虽然缺乏充分的统计学资料,但仍可以看出表现为下降趋势。定量观察可以见到模型有明显的畏寒行为,模型肝细胞和活体耗氧量均下降。模型肝内和脑内锌、铜、铁、锰、铬等元素中仅肝内铜有上升,模型卵巢HCG/LG受体解离常数上升,受体亲和力下降[56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70]。18脑内市域结构的变化文献报道了应用具有不同药效学性质的甲状腺抑制药物进行造模的实验[71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81]。丙基硫氧嘧啶模型动物T3、T4含量下降。与甲切模型有所不同,模型中枢内去甲肾上腺素含量无显著变化。大脑皮层、海马肾上腺素能B受体减少,肾上腺素能α1受体和小脑肾上腺素能B受体无显著变化,反映出模型脑内交感神经系统活动减弱。陈氏等结合下丘脑内多巴胺的代谢产物高草香酸增多及多巴胺羟化酶增多这一结果,认为儿茶酚胺系统代谢比较活跃。应用丙基硫氧嘧啶7d或15d动物,其血内尿氮呈现上升趋势。其中15d的肌酐含量有所增加。对血浆二氧化碳结合力阴离子间隙和血氯等检测显示模型有酸中毒表现。模型血糖无明显变化,用药15d钾钙钠中仅血钙有增加。他巴唑模型在已有的检测项目中与丙基硫氧嘧啶动物大体一致,另外模型血清cGMP含量的升高,血SOD减少,脑内丙二醛含量增加,显示造模有一定细胞毒性作用。模型还有胸腺、睾丸重量下降,模型肝、肌肉、垂体、心等存在不同程度的组化和病理改变。甲基硫氧嘧啶模型有睾丸、胃、十二指肠的病理改变,血浆皮质醇含量减少。但与甲基硫氧嘧啶和他巴唑相比,甲基硫氧嘧啶的副作用最强。尽管只有0.03%的浓度。到底所观察到的现象是“肾阳虚”的表现抑或是药物副作用,还有待鉴别。19动物模型的改变在口服羟基脲的直接作用下,模型肝脾DNA合成率下降,脾组织NK细胞活性下降,巨噬细胞数量下降,IL-2含量下降。模型血浆中T3、T4含量增加。模型动物同时有促卵泡激素减少,雌鼠交配生育能力下降,尿中17羟类固醇、17酮类固醇减少,胸腺、肾上腺组织中皮质醇含量也减少。造模具有一定生物毒性作用。模型血浆中分子物质增加,总巯基减少。模型体温下降,心率下降,游泳时间、耐冻时间缩短,血红蛋白含量下降,除钙、锌,镁、铁等元素无明显变化外,铜元素有所增加。模型腓肠肌、肺、肝、睾丸、脾、前列腺-精液腺、胸腺、提肛肌等重量下降,但肾上腺重量无明显变化[82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96]。同时廖氏等还发现以羟基脲灌胃3月的动物同样有骨质疏松表现,动态与静态的骨组织形态计量亦证明了这一改变。作者对比了羟基脲与泼尼松致骨质疏松动物模型骨质的改变,发现“泼尼松主要抑制了该面(外骨膜面)成骨细胞的活性,使骨的形成减少,其结果导致皮质骨变薄”,而羟基脲“使(内骨膜面)破骨细胞的功能极度活跃,从而骨的吸收明显增加”。作者尝试分析了两种药导致骨质疏松的不同机理,这一结果再次在病理层面上为同证异病提供了证据和新的思路。20激素对人体的功能影响皮质激素造模是应用最广泛的造模方法。大量的实验研究观察了皮质激素肾阳虚模型几乎全身所有系统的变化。包括模型机体代谢水平下降,免疫功能下降,广泛的器官病理损害,中枢神经系统和植物神经系统功能的改变,体内各种激素含量、脂质过氧化物的增加和自由基清除系统功能的低下,血细胞系统各种成分,血液内各种离子浓度,血循环流变学等方面都有不同程度的变化。组织器官内环核苷酸和核酸的变化曾被作为最有效的指标而进行大量的检测。皮质激素造模其用药及成模时间一直在变化。从开始的短效到长效激素,从连续用药到间歇用药并且停药,从1～2周到30d,从皮质醇制剂到皮质酮制剂。施氏等还通过组化方法对比观察,认为皮质醇酮模型短期(7d)内属阴虚,若10d后属阳虚等。肾阳虚证动物模型如果说以上的动物模型都可以模拟临床上阳虚的某一方面或某多方面病理的话,那么目前还未有可以应用于所有肾阳虚证诊断的“金指标”。曾经被相当一部分研究者接受的cAMP/cGMP,以及体内皮质醇和T3、T4水平及T/E等都不例外。沿用以往对阳虚证动物模型的称谓,我们仍将其分为“传统病因”模型和“病理”模型。尽管愈来愈多的观点赞同以前者造模,但它仍然存在缺点。坚持者执着于传统病因才能导致中医的证候。1中医证候模型的建立1987年吕氏就已经提出:“中医病因学的观点很多是来源于`审证求因’,尤其是六淫邪气,即使有的是直接原因,但时过境迁,这种直接原因现在已经很少存在了。”在中医学诊断中,一种“病”因可致多种证,多种“病”因可致同一证。中医的“病”因与西医的病因已经相去甚远,应该称为“证”因更为妥当。中医证因与证之间的关系是不确定的。一旦确定下来,迟早可以用西医的病因去统领。而我们却要不断地寻找使传统病因模型标准化、规范化的道路。殊不知,当中医证候模型的造模方法确定下来的时候,研究对象已经悄悄地转为病的研究而不是证的研究了。因此传统病因模型既无标准化,亦无法标准化。2肾阳虚模型的辨证类型传统病因模型往往理所当然地认为作用在人身上病因必定会引致相应的证,而忽视了造模后对动物进行辨证。早在1983年,王氏就对有关动物模型的研究提出过看法。动物的外观表现“虽能联系人体疾病的某些症状和体征,但选择的这些多不一定是本质性、特异性的项目,它既可见于此证,也可见于彼证尽管人们认为“畏寒喜暖、体毛枯疏”等宏观表现可以作为模型动物肾阳虚的症状但资料显示肾阳虚与脾阳虚证甚至脾气虚证的动物模型都可以有以上表现。陈小野等提出还要通过补肾阳药物治疗有效以反证其为阳虚证。而事实上温阳法、补脾气法(黄芪)、滋阴法(生地知母)等均可使阳虚的指标得到不同程度的纠正。结果可能会出现这样一种情况:一个辨证具有上述外观表现的动物,通过助阳药验证,得出结论为肾阳虚模型,而实际上这是一个脾阳虚模型或脾气虚模型。这样的结果似乎不能单纯以中药的适应原作用进行解释。中医症状的辨证归类是经过长期经验总结的成果,但这种总结并不是完全遵循一定的指标原则进行的。有很多症状的辨证归类是根据医者自身经验、临床医疗实践总结出来的。按照中医的传统,医者会自觉地将自己的经验所得依附到传统理论中去,以求得合理的解释,这种解释往往是单向的,但对动物的辨证却是以往医家未曾顾及的问题。在人与人之间进行辨证已经有如此许多的差异了,更何况人与鼠之间?如果完全根据中医学基础理论去逆向研究这些问题,只会陷入死胡同。3中医主症考证传统病因模型困难更大,因为它比后者更依赖于动物的外观症状表现并作为诊断依据。传统病因造模往往有证无主症,而中医诊断从来都是症证结合。所有的报道以传统病因模型造模的文献都没有谈及到底所造的模型其主症是什么?主症是中医临床诊断治疗的最根本依据,病案中的主诉记录的就是主症。没有主症便没有对主症的描述,便没有对主症的辨证。据何而谈证呢?口渴可为阴虚可为脾虚,阴虚之渴而欲饮,脾虚之渴而不欲饮。泄泻可为气虚可为湿热,气虚之泻而溏,湿热之泻里急后重而带粘液。并非研究者不知道要对症状进行描述,而是因为与动物无法交流,所以无法进行描述。因此只好求助于全身症状的综合辨证了。但一来因为同样的原因使可供参考的症状有限,二来辨证无典可循,结果出现了几种证模型诊断标准的重叠。4调查的结论应用病理模型所要模拟的病理现象往往是从医疗工作者长期的实践中总结而来的规律。沈自尹等以尿17羟皮质醇含量下降为肾阳虚的指标,是经过临床实践和深入基层进行一定数量调查后所得出的结论,然后应用于实验。如果说肾阳虚腰痛与肾阳虚皮质醇减少在实体观察上属不同层次的话那么至少他们在方法论的层面上是一致的。这种临床观察所得出的规律是相当宝贵的经验。病理模型易于实现标准化。借助现代医学的成果,病理模型的确可以实现相当大程度的标准化和规范化,也容易量化。目前对中医证候指标的研究多停留在有无变化的水平上(因为统计检验中P值的大小,往往只说明有无差异,而并不说明有多大的差异),很需要在量的精确上再进一步。5从药证结合模型的病到证的结合两种造