天然蒽醌化合物对植物病原真菌生物活性及作用机理研究

开发生物活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的生物合理农药目前已成为农药发展的新趋势，本研究从植物中寻找高活性的天然产物，并研究其相关特性，以期为新农药的开发应用提供依田问试开发生物活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的生物合理农药目前已成为农药发展的新趋势，本研究从植物中寻找高活性的天然产物，并研究其相关特性，以期为新农药的开发应用提供依田问试验结果表明，药用大黄的乙醇提取物，对黄瓜白粉病和番茄灰霉病菌具有良好的防效果．其稀释IOO倍和250倍的防效分别与对照药剂15．,4--唑酮可湿性粉剂稀释1000倍防治采用活性追踪和色谱法分离纯化植物大黄和巴天酸模中的活性化合物，利用现代波谱技术进行化学结构鉴定，确定为大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄素．1，6．二甲醚和大黄酸。蒽醌衍生物在对植物提取物对病原真菌的活性中起主导作用，7个蒽醌衍生物的抑菌谱测定结果表明，在1物活性，明显优于极性较高的蒽醌衍生物(含羟基较多或羧基)大黄酸、大黄素、l，8．二羟基蒽药用大黄提取物中的蒽醌化合物大黄素甲醚对白粉菌的活性优于大黄酚，化合物之问对植病原菌的活性存在增效作用。对于小麦自粉病菌，丈黄素甲醚和大黄酚组合物的增效比率R值(理论EC√观察EC∞)为O．99-2．78．对于黄瓜白粉病菌，大黄素甲醚和大黄酚组合物的增效比率为1．Ol~4．06。大黄索甲醚和大黄酚在组合物中的比率为6：4--9：l时，对小麦白粉卤和黄瓜白粉菌的活性表现为加性效应。比率为I：9巧：5时，表现为增效作用，增效水平随着大黄酚在组合物中的比率的增高而升高。当天然产物直接用作生物i!ii农药时，活性成分的种类和比率都需要确定以保证防效的稳定性2004～20059个地区262个向粉病菌株的Ec”值的分布成正态分布，ECso值的变异范围为0．153-．-mLl，平均值0．304岖mL"1为敏感基线。116个霜霉病菌株的ECho值的分布成正态分布，Ec”值的变异范围为0．280．,-0．748lagmL"‘，平均值0．501lagmL"1甲醚选择压力下，Gi,．．．4315的EC50值变化范围为0．249,．0．395lagmUl，与初始GO的EC”值0．301峙mL"成的附着胞大部分为畸形，不能形成吸器原体；接种后8h喷旖大黄素甲醚的畸形附着胞比率清水处理的5,-．6倍，能减少约90％的吸器原体形成比率：接种后24sh2甲醚，仍能不同程度抑制初生吸器和菌落的迸一步生长发育。并减少单菌落形成吸器的个数，从而最终减少叶段上病斑数。大黄素甲醚对小麦白粉病菌生长发育的各个阶段均有一定作用，最显著的作用发生在入侵之前，即吸器原体形成前的阶段。大黄素甲醚对小麦白粉病菌和黄瓜灰霉病菌在离体条件下没有直接的抗菌活性，但在活体条件下活性很高。挑战接种试验结果表明该化合物局部诱导了植物对病原菌的抗病性toenvironmentsisbeingpaidattentiondevelopbiopesficldeswithsafetoIIOOtalgetsintheworld．他thesisevaluatedbioactivitiesandactionmechanismoffrom见锄spp．agailIstplantcompoundon幢assessmentoffieldcontrolindicatedthattheethanolexlfactoffrom足。疥cucmberpowderymildewandtomatogreyhighefficacyonefficacyoftheplantthatoftriadimefon15％WP越1000fold250agahmequalcucumberpowdorymildew,andthatofpyrimethaniltoenvironmentsisbeingpaidattentiondevelopbiopesficldeswithsafetoIIOOtalgetsintheworld．他thesisevaluatedbioactivitiesandactionmechanismoffrom见锄spp．agailIstplantcompoundon幢assessmentoffieldcontrolindicatedthattheethanolexlfactoffrom足。疥cucmberpowderymildewandtomatogreyhighefficacyonefficacyoftheplantthatoftriadimefon15％WP越1000fold250agahmequalcucumberpowdorymildew,andthatofpyrimethanil70％WGdilutedat1000andrbeintheirchemical蚰u咖isolatedanthraquinones—1,6-dim剧hyl-cmodin．emodin,rhein,alizarinand1,8-dihydrogen-anthraquimmew啪usedtoschrysophanoland1,6-dimethyl-emodinlipophilicityhadhighbioactivitiesOngrammisandMaganaporthegrisea,bIlt／nvitrottIeydidnotnearlyinhibitthehyphalcinerea．Sclerotiniaro必ii,Physalospora l，8-dihydrogen-anthraquinonewith8．gramini镕andMg啦eo。weakerbioactivities／nvivoExperimentswereconductedinlaboratoryand掣胃mhou辩todeterminetheinteractionwasmildewandmildews．TherebioactivechrysophanolathetwoOildiseases ratiosofinteractionfroml19toincreasedwiththechrysophanolsynergisticinthecombination．Thefindingindicatesthatinordertoensuiechrysophanoleffie∞yoftheethanolextractofrheumrOOtSOildiseases,boththeactiveingredientsphyscionandchrysophanolhavetobeendtheproportionTopmvidebasicdatafortheriskassessmentoffungicidalresistanceforthiskindofplamann髟fortheestablishmentofsensitivitybaselinesselectedphyscionpowderypopulationsbasedOilisolatesofS．fuligineafrom9他giom，andl16isolatesofP．cubensisfrom6regionsjnChinaduring2004—populationsbasedmildewisolateWaSmonitoredforfifteensensitivityofunderresultsshowedthattherewaspressureofforeitherregiO邶distributionoftomildewisolatesormildewⅡnornudunhnoddcl撇whhmcllllECs00．304PgmrlforpowdaymildewpopulationandIl伽IECThevariationsofnornudunhnoddcl撇whhmcllllECs00．304PgmrlforpowdaymildewpopulationandIl伽IECThevariationsofsensitivitytophyscionwflresmall0．501 fordownymildewthefactorsvariedfrom1．63to3．42艇_dfrom1．70to2．38amongpowdoIyanddownyisolatexz4didpopulagons,respectively．TheattheofEC_’eforWhenphyscionwasappliedinoculation,thegerminationofconidiaWaSinhibitedandap畔 rateafterinoculationn砖thepfimaryh锄ls幻riawasreducedand曲峙numberofcolonyasignificantlyinhibitthegerminationPhysciondidnotinhibitthegerminationofconidia加conidia由，v／vo．andchallenge- showedthatphyscioninducedtheratherthanthesystemicresistanceofhostplantsagainst独创性声本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研独创性声本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得确的说明并表示了谢意聊时间关于论文使用授权的说研究生魏枷r俐20世纪s¨0年代20世纪s¨0年代，国内外许多专家认为，化学农药的使用将走到尽头。逐步取而代的将是生物防治、物理防治和综合防治等(Heinrichs＆Mchida1984，Pngali＆Goger1995，屠予钦＆袁会珠1996)．但事实表明，在可预见的历史时期内，农药和化学防治法仍将无法完全被取代，开发生物活性高，对非靶标生物安全、环境相容性好的生物合理农药目前已成为农药发展的新趋势(马志卿d以2000)。目前我国小麦、水稻，玉米和棉花的种植面积约93337J-hm2，蔬菜、烟叶种植面积约3万hm2；粮棉田年用杀虫剩30万t以上，蔬菜田年用杀虫裁8万t以上，因此，农业生产对农药的蔼求量很大(曹雅忠甜烈植物源农药作为生物合理农药的一部分，以其低毒、选择性高、易降解等独特优势迎来了新的发展机遇。据报道在中国有100种重要的作物有害生物，其中约720种是病原物，占近45％(Go2004)，杀菌帮的研究开发任重道远，加强新型天然植物源杀菌剂的研制，是防治植物病害的重要途径之一．用于植物源杀菌剂的植物资源植物产生次生代谢物抵御病虫害的侵扰是植物与有害生物相互适应，演变、协同进化的结果(马怎卿eta1．2002)。地球植物资源丰富，其产生的次生代谢产物超过40万种(李永刚da1．2002)，种类繁多的植物次生代谢产物是开发植物源杀虫、杀菌剂的物质基础。因此，植物源杀菌剂研究开发的空间相当宽阔。与传统化学农药相比，植物源农药有其自身独特之处。①环境相容性好。植物源农药在自然界有其顺畅的降解途径，对环境污染小。②生物活性多样。植物源农药不仅具有杀虫活性，还兼有杀菌和调节植物生长的作用，且作用方式多样．③对高等动物及害虫天敌安全．大多数植物源农药触杀作用不强，对害虫天敌影响很小．④有害生物不易产生抗药性．植物源农药往往含有数种有效成分，且作用机制与一般化学农药不同，不易使有害生物产生抗药性．⑤对农作物安全，而且有的植物源农药有利于作物生长(刘长令&李正明2003，徐汉虹2001，江绍玫2000，1997)．国外直接利用植物源农药主要发生在19世纪，从目前的资料查询，国外已经登记的有巴碱(Coppingetal．1998)，而市场上销售的品种有30余种(高菊芬2001)．我国目经登记的植物源有效成分目前有16-18种，由此而延伸的镧剂有100余种。我国已经登记的效成分包括；烟碱、鱼藤酮、藜芦碱、茶皂素、川楝素、印楝素、荫蒿素、百部碱、苦皮藤素、苦参碱、松脂合剂、马钱子碱、异羊角扭甙、乌头碱、茛菪烷碱、芸苔素内醋、蓖麻、油酸、骨酯素；正在研究和登记的有效成分有：砂地柏、蜕皮素A、毛茛碱、螟蜕素、2．蒎烯、蜕皮酮、香茅油、雷公滕碱、银杏黄酮甙、夹竹桃甙、牛儿酵、莰酮等(史卫国et矗1997，徐汉虹2001)。参碱、烟碱、雷公藤碱、百部碱、马钱子碱、莨菪碱，血根碱，小檗碱、苦豆子碱、藜芦碱、辣椒碱、博落回碱、芦竹碱、乌头碱等。②藉烯类：如印撩素、川探素、苦楝、苦皮藤素、苦皮藤醋、闹羊花素Ⅲ、雷公藤甲素等．③黄酮类：如鱼藤酮、毛鱼藤酮等。④精油类：如桉树油、薄荷油、菊蒿油、茼蒿油、芸香精油、肉桂精油、猪毛蒿油、丁豆油等．⑤光活化毒素：如7·苯基-2,4。倾三炔、茵陈二炔、金丝桃参碱、烟碱、雷公藤碱、百部碱、马钱子碱、莨菪碱，血根碱，小檗碱、苦豆子碱、藜芦碱、辣椒碱、博落回碱、芦竹碱、乌头碱等。②藉烯类：如印撩素、川探素、苦楝、苦皮藤素、苦皮藤醋、闹羊花素Ⅲ、雷公藤甲素等．③黄酮类：如鱼藤酮、毛鱼藤酮等。④精油类：如桉树油、薄荷油、菊蒿油、茼蒿油、芸香精油、肉桂精油、猪毛蒿油、丁豆油等．⑤光活化毒素：如7·苯基-2,4。倾三炔、茵陈二炔、金丝桃素、香豆素类等．@番茄枝内酯：由35-39个碳原子构成杀虫剂鱼藤酮及有机磷杀虫剂乙酰甲胺磷高得多。⑦其他；羧酸醋类，如除虫菊醣：木脂索类，200l，a／．202，操海群etLeta／2004)．天然蒽醌衍生物在植物体中广泛存在，许多已经是传统中草药的活性成分，用于人类抑菌、ea．197，Cangt／．196199，涛eta1．2000)。天然蒽醌衍生物对植物病原真菌的活性的报道并不多见，更无系统的报$CChoi物界只有蚊科节肢动物及海百合纲的海洋动物中被发现。天然总醌分为大黄素型和茜素型中药如大黄，决明子、虎杖等中都有含这种结构类型蒽醌。大黄素是分布最广泛的一种葸醌化物，从许多霉菌、地衣、高等植物及昆虫均有发现．图I．1列出了五种大黄素型羟墓蕙醌。举喁毋OpOH锄鼬DOil势O哂举Oa图1．1晦1-Thechemicalstructureaoffive2药中。主要的茜草型葸醌结构见图n_岫^K痂P舅u图l-2sir．．1-2Thechemicalstructuresofthree药中。主要的茜草型葸醌结构见图n_岫^K痂P舅u图l-2sir．．1-2Thechemicalstructuresofthree迄今为止，还发现了一些特殊的蒽醌类化合物et以1999)．如藤黄科植物madaysim中含有异戊烯醚基团；鼠李科植物的嘲觚砌w含有p，}二甲基取代科植物的中有乙烯基取代基：曲霉中aversht有歧链的四碳取代基等；此外还有芳烃取代的化合物如紫胶虫分泌的紫胶中虫漆酸甲acid)；白合科植物的knipholone。Sekar从Cassiaobtusa中分离出两个新的葸醌类化合物。通过IR、MS、1HNMR及元素分析确定了它的结构 定它们的结构。并对它们的抗氧活性和构效关系做了研究。eta／．(2004)^Ad)aylilies中离出9个新的蒽醌类化合物，测定它们对乳腺癌，CNS它们的lC∞为1．8Itgml"1-21．Ipgml"1。Maria等 一种霉菌Drechsleraa嗍的代谢产物中分离出一种新的蒽醌cynodontin(3．methyl-5tetrahydroxy-anthanthraquinone)，并对它的活性进行了研究。结果表明，该化合物Y时的生长有明显抑制作用，而对其它种类的霉I暂没有抑制作用蒽环类化合物是最大类抗肿瘤的葸醌衍生物。这类葸环类坑生素首次AkStreptomyces的代谢产物中分离获得(张蓉颖eIaLl999)．它们的共同结构特征是大多数化台物含有一个由个共平面的六元环所构成的四苯并三苯醌发色团(Wang“o／．1993)，是一类非常有效的抗癌et以(2000)报道合成了一系列l，3．二羟基-9，lO．蒽酮的衍生物(结构见图4)，并测定它们对Hep3t3，PLC／PKF／5等7个肿瘤细胞抹的抑制作用。绝大多数衍生物都对这7照显的抑制作用，构效关系表明，N．响化合物的活Huangeta／．(2003)报道在葸醌的l，5位上连接了1,5．双硫代和l，5．双酰氧基团并研究了该系衍生物对聚合酶的抑制作用，发现这些葸醌衍生物对癌细胞的hTERT的表达没有抑制作用，但3个衍生物对正常细胞中的hTERT产生激活作用。这种现象暗示着这些蒽醌衍生物在细胞的寿中起着重要的作用Dinorab基因，如3．羟基丙氨基：另一类是有氧化还原作用的基团，如硝基芳香基团，吡啶和吡啶翁等结果表明，具有阳离子取代基的衍生物具有细胞毒作用，而没有氧化还原活性；有氧化还原作的衍生物类对P3883第一章文献综a／．(1997)根据大黄酸的结构合成了由于二乙酞大第一章文献综a／．(1997)根据大黄酸的结构合成了由于二乙酞大黄酸能用于治疗骨关节炎Daneta／．(1995)在蒽醌的l和2位上引进了一系列顺铂类络合物，从中研究蒽醌和顺铂化合物与DA作用的协同效果，顾铂、DA和插入剂三体系相互作用的关系，以及它们的抗癌活性，结果表明：连接在蒽醌l位上的顺铂类络合物比2位上的抗癌活性强，与DNA／怍用的键合常数测定2．2．1气相色谱Lewis曾试验在熔凝硅石毛细管柱上分析了18种天然蒽醌化合物。先把蒽醌化合物硅醚化后再用气相色谱法分离。每一个化合物的峰都能被鉴别出，利用此法从决明然葸醌类化合物制备成衍生物。已报导的衍生物有三氟乙酸酯、甲醚、三甲基碎醚等，它SE-30、UCW-98、OV-17等同定相上能得到良好的分离效果。蒽醌衍生物的保留时间随羟基的2．2．2高效液相色谱Ohshimaeta1．(1986)使用梯度溶剂洗脱的HPLC荟大黄素和大黄素的葡萄糖甙等。刘三康等(1998)片IHPLCC18色谱柱，甲醇冰(78：22)其它葸醌化合物。唐小波等(2000)采用检测波长254nm，2．2．3薄层层析RaietaL(1981)在硅胶G薄层板上，应用适当的展开剂，能将大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸和芦荟大黄素等5种蒽醌类混合物较好的分离开。所用的展开剂为：甲苯一乙醚-乙醇(4：1)。Rai等(1982)和异丙醇．乙酸乙酯．水(4：4：3)2．2．4毛细管电泳腈缓冲溶液，毛细管柱75姗Ai,d×60cin，上作Od,压19kv，紫於检测波长254nm，在10miIl有效的定量检测大黄素、人黄酚、大黄酸、人黄素甲醚和芦荟人黄4中国农业大学博上学位论22．5碱梯度提取碱梯度提取法是从中国农业大学博上学位论22．5碱梯度提取碱梯度提取法是从中草药中分离天然蒽醌化合物最常使用的方法．该方法是根据天然蒽酮酚羟基的酸性及蒽酮环上a’B’·r掘基的酸性的差异，依次用5％KHC03、5％Na2c03、和大黄酸等002-I临界流体萃取002．at矗采用硅胶柱层析法，洗脱溶剂系统有石油醚一氯仿、正己烷·乙酸乙醑等2．2．7高速逆流色谱(Yicio1996(2006)统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了分离研究，采用三氟乙酸作为保留酸，氨水作为洗脱碱，95析，证明得到了大黄蒽醌的五种纯物质(Vaslikiotis＆Alexaki- 1972)和荧光法(Fakecva＆Tsirulnikova1980)，此外还可1978)等，20世纪80年代以来的新方法有离子反HPLC法(Gagliardi“01．1987经活络，止咳怯痰等功效，还能抗菌，抗病毒和抗癌等．在对植物病原菌的活性上也有一些究朱廷儒等报道(1985)，从虎杖中提取的醚溶物经色谱柱分离得到大黄素(emodin(phscon)198，Changetal．1996)，大黄素、大黄素．8一葡萄糖甙等对金黄色葡萄球菌、肝炎双球菌有抑制作用。MIC51993)。李成林(1989)报道大黄索对金黄色葡萄球菌209P、大肠杆菌1993)。李成林(1989)报道大黄索对金黄色葡萄球菌209P、大肠杆菌球菌作用不明显福氏痢疾秆菌均有抑制作用。苟奎斌等测定了来自大黄的4种蒽醌类化合物即大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸皆对胃幽门螺旋杆菌(I-if')较强的抑制作用，同时证明无抗菌作用的某些成分对HP的生长也有抑制作用(苟奎斌eta1．1997)．Agatwal等从大黄(Rheumemod／)的根部分离出大黄酸(rein)、大黄素甲醚(phycio)、芦荟大黄素(aloe-eodin)和大黄酚(chrsophan0)等蒽醌衍生物，生物活性测定表明这些蒽醌衍生物对白色假丝酵母(CandMaalbicana)，新生隐球酵母(o弦魄口∞Ⅺnon)，发癣菌属(chnegpe)和烟曲霉(Aelafumigatus)均有不同程度的抑菌活性，MIC在25pgmLl—250pgmL"1(Agarwaletal．2000)。等(Levinetal．2000)的研究表明从芦荟中提取的总醌类化合物对细菌Bacillussubtilis有抑制作用机理是抑制了核酸的合成．)报道大黄索剂量为‘，在离体条件下能分别抑制9种土壤细菌(．m，4种inwtriquetra担子菌Free．Wilson和Hansch方法对六茜草素及其衍生物的抗菌活性进行TQSAR葸醌有较强的抗菌活性<粱剑平et以2．3．2抗病毒作大黄素等葸醌类物质具有抗病毒作用，可抑制乙型肝炎抗原阳性。治疗慢性肝炎，急性性肝炎(张喜云1999)。Susan(2001)等报道了大黄酚能有效的抑制小儿麻痹病毒2型和3mL"1和其lc"分别为O．21ttgmL一。Raymond等(1990)报道了大黄素等蒽醌抗HIV病毒研究结果，其中大黄素抗HIV-I活性的Ec∞为36．3tiM。Sydiskis(1999)和Anderson等(1999)道虎杖大黄素对HSV-I、HSV-22．3．3抗癌DNA碱基对中，破坏DNA的转录和复制。另外在细胞氧化还原的代谢环境中，总醌化合物能产05H20，在某些具有还原性的金属，如铁、铜等作用下，产生高活性的OH"，影响DNA合物能抑制人早幼白细胞(HL-60)。机理主要是抑制细胞DNA和RNA的合成。以大黄素的细胞毒作用最强。大黄素比箕葡萄糖甙具有更强的细胞毒作用，而其他成分没有这种构效关系．大黄素对小鼠肉瘤、小鼠肝瘤、小鼠乳腺癌、小鼠艾氏腹水癌、小鼠淋巴肉瘤、小鼠黑色素瘤及大鼠瓦克癌等7个癌株的抑制率均都在30％以上(钥键&郭力芳1993)。胡凯文等(1998三种已对阿霉素、柔红霉素产生多药耐药的肿瘤细胞株为研究对象，观察大黄素、大黄酸对上敏感细胞更易受到杀伤。su甜a／．(1995)报道采用SOS染色测试技术。研究大黄素抑制1-NP6肠杆菌PQ37基因的突变的作用．实验结果表明大黄素能阻止和压制i-NP对大肠杆菌pQ37的基因突变．HisasMet吐(2001)评价了从植物中提取的一系列蒽醌类化合物的抗人乳腺癌MCF-7的作2．3肠杆菌PQ37基因的突变的作用．实验结果表明大黄素能阻止和压制i-NP对大肠杆菌pQ37的基因突变．HisasMet吐(2001)评价了从植物中提取的一系列蒽醌类化合物的抗人乳腺癌MCF-7的作2．3MCF7没有鳌合的羟基对抗癌活性是很重要的．研究结果还证明大黄素等蒽醌类化合物能抑制17¨E二醇结合人体雌激素受体(Eft)．ZhangetaL(1995)，王淑如＆陈琼华(19'77)和肖军军等报道了大黄素具有抗乳腺癌和抗肝癌的作用郑丰等(1994)报炎初期缺血(吴建西，1997)．祁红等(1999)报道大黄素具有显著抗炎作用，一次口服‘—60mgkg-I能显著抑制角叉菜胶致小鼠足跖肿胀，60mgkg．1—100mgkg．1能显著抑制角mg 制醋酸引起的小鼠毛细管通透性的增加。腹腔给药40mg蟮1能显著抑制角叉菜胶引起的犬鼠急胸膜炎的渗出与白细胞游a／．(1995)类化合物对脂类氧化有很强的抑制作用，抑制作用比维生素E还强。 at．(2000)采用硫酸盐方法，以亚麻酸为氧化对象。测定大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素等醌类化合物的抗氧化作用，抗氧化活性顺序为芦荟大黄素>大黄酸>大黄素。而大黄酚则加剧讵麻酸的氧化．他们认为大黄素和芦荟大黄素的抗氧机理与羟基有很大关系。人黄酚的氧化活性是由丁．提高了自产生能力乏3．6大黄素类蒽醌注射液对麻醉兔有明显降压作用，连续给药几次后，药量蓄积，小剂量即可引起血压骤降甚至死亡。大黄素类蒽醌注射液对麻醉兔有明显减低心率作用，未发生心电图有其它改变(方秋文1982)。大黄素对多种血管有舒张作用，能抑制5．羟色胺对血管的收缩作用(吴建乞3．7在离体豚鼠回肠实验中，用大黄素1．9雌mL"1剂量时，可使肠管肌肉张力短时增高，振幅增调正作用(吴建新eta／．1997，吕金胜et口，．2000，靳珠华etaL1984)．2．3．8修复损伤的t}ttMt保护大脑皮层神经元功7第一章文献综马琼英等(1999)报道大黄素浓度为10第一章文献综马琼英等(1999)报道大黄素浓度为10艇几时对人胚大脑大脑皮层神经元有保护组分Chagea／．199DNA修复O姬R)，RCCL王文俊等(1995)报道大黄素具有激活单核细胞分泌肿瘤坏死因子a(TNF-a)和白细胞介l'6，8(ILl，I¨，11．,-8)作用，并且能抑制内毒素诱导的上述因子的分泌。他们还报道(1995黄索能协调植物血凝素fH)并激活单核细胞分泌I-2和干扰紊TIFN大鼠肠粘膜的组胺含量恢复至正常水平(109kg"1灌胃或loogkg。腹腔注射)。焦建杰等()认为大黄素可抑制白三烯B4(L1m4)的生物合成，抑制大鼠腹腔巨噬细胞(M甲)生物合成其抑制的浓度范围5xlo-7．5xl矿M的大黄素相当氟灭酸(1×l旷M)的抑制作用，对前列腺2．3．10对细胞内外ca“的19a．1995)(IF．C)c2(15)荧光指示剂乙酰羧甲酸方法分析了大黄素对大鼠肝细胞内Ca2+浓度影响，预先经过大黄素mM)处理10min，在静息状态或加入M的CaCl2和Kcl后，细胞内ca2+均比对照组明显增2．3．¨对基因袭达的影姜晓峰等(1999)报道大黄素能抑制小鼠艾氏腹水癌细胞对【3H】-胸苷的跨膜转运，其lc，o9．9“M，能增强抗癌药5一氟脲嘧啶丝裂霉素和氨甲蝶呤对人肝癌BEL-7402的细胞毒作用，并分逆转人乳腺癌细胞MCF．wAdr对饲霉素的抗药性。丈荧素能增强罗丹明123在MCF-T／Ad嘲胞中蓄积并减少其外捧，长时间作用降低了P-糖蛋白的表达，表明大黄素逆转抗药性的作用与抑核苷转运、降低P．糖蛋向的功能和表达相关。刘志红等(1996J]包C-myc原癌基因表达的影响。大鼠生长相对静止状态时的肾小球系膜细胞(Mc)的c-mycmRNA表达，细菌脂多糖(LPS)10mgL-130sc-myRNA高效应在2．5h6h，(25mg2．3，12对酶活性抑制作陈万生等(2001)研究了大黄素·8一良B．m毗喃葡萄糖苷(PMEO通过小鼠跳台实验以及胆碱酯酶活力测定，表明PMEC碱所致学习记忆障碍具有防护作用，对乙酞胆碱酷酶具有可逆的抑制作用，其lc，0为进行抑制活性研究，结果表明大黄素对PTKs有强的抑制活性，IC50为5#M。大黄素甲醚和大8素．8-O-D葡萄塘无抑制活性，并且证明大黄素是一种非竞争性抑制荆，其机理是阃接性的调节ATP的结合位点。Yimeta／．(1999)报道了大黄索可选择性地抑制酪蛋白激酶II(ⅪI)的活性，roP蛋白激酶白激酶C(PKC)。cdc2，酪蛋白激酶素．8-O-D葡萄塘无抑制活性，并且证明大黄素是一种非竞争性抑制荆，其机理是阃接性的调节ATP的结合位点。Yimeta／．(1999)报道了大黄索可选择性地抑制酪蛋白激酶II(ⅪI)的活性，roP蛋白激酶白激酶C(PKC)。cdc2，酪蛋白激酶I(CⅪ)和酪蛋白激酶Ⅱ(Cl(1I)，大黄素对CKil的IC豫为2pM，低于其他激酶2．3个数量级，酶活力分析表明，其竞争性抑制CKll的活性，抗ATPKi值为pM。表明大黄素是一种选择性的CKII抻制荆，机理为间接性的调节ATP的结合点。茜素可与DNA拓扑异构酶产生强相互作用．茜素是HIVI蛋白酶的小分子非肽非竞争性抑制剂，此类型结构的化合物有望发展成为预防和治疗AIDs的新药物(Koziowski＆Watson1992，Brncoth＆Faril95)．茜素对从人体组织和鼠肝中分离得到的GST同功酶均有不同程度的抑制作用(Dasta／．1986)．还可抑制谷胱甘肽还原酶(Bimnaiteeta／．1991)(CostanfionetaL1996)．茜素对体外非酶促和酶促的脂质过氧化均有抑制作用(LiuetaLHuangetaL(1995)认为茜素对脂质过氧化作用的抑制高于维生素E，并且二苯基-问三硝基苯腙肼试验证实茜素是自由基清除剂2．3．13Mullereta／．(1999)采用单细胞琼脂糖电泳技术，小核测定及突变实验对大黄素、大黄酚，大会产生基因毒，而大黄索甲醚和大黄酚不会产生基因毒。但是他们认为在人们正常的平衡饮食况下，蔬菜、草药和果汁中的大黄素不会产生基因毒的风险。对于l，8乳动物产生基因毒尚无定论(Brusick＆Mengs1997)。虎较蒽醌衍生物99kg"1一周未见死亡(钥键&郭力芳1993)。Stefan等(1999)研究了大黄素及芦荟大黄素等蒽醌化合物对哺乳动物细胞基因毒。研究了大黄素及芦荟大黄素等葸醌类化合物与小牛胸腺DNA朴酶¨和小鼠淋巴瘤L5178Y的作用，同时与对照物m-AMS、EMS进行比较。实验结果发现大黄和芦茎丈黄素不会引起基因突变乞3．14化摩作化感作用是指一种植物通过释放化学物质到环境中对其他植物产生的影响cachalinense提取的大黄素对莴苣(Lactucasativa)、白蔸菜eta／．(1993)报道从植物viridis)和牧草(Phleumpratense)幼苗的生长有抑制活性。大黄素在剂量为10mL-I．100峙mL-1能抑制向日葵(局嘲∞胁mmⅢW，LD∞为45pgmLl’和玉米LD∞为65mLl)2．3．15对檀物病原蕾的安银岭(t994)等报道了大黄素、大黄酚、大黄酸等化合物对植物病原真菌细链格抱Vat．castaneaestenuis)、盘多毛孢(Pestalotiaspp．)、栗盘色多隔孢(Coryneum9—■_量大墨位|—■_量大墨位|文■■■■■■—目●■■—目墨量皇—■■—■■|量—■●●■鼍量曼皇■■■■—■■—大麦白粉菌(BlumeriagraminiJf．sp．HordeD有良好的活性，Ec如分别为4．7峙mL"1、0．48腭mL一，对稻瘟病菌(Magnaporthegr缸ea)有较好的抑制效果，但对供试的水稻纹桔和20．0肛菌(Coractumsasakt)、番茄灰霉病菌(BotrytUcinema)、番茄晚疫病菌(Phytophthoratnfest,aⅡ)tora)的种子的提取物中分离到大黄素、大黄素甲醚、大黄酚和大黄酸等蒽醌类化合物，并证它们在盆栽条件下对供试的小麦白粉病(Blumeriagramlnlf￡sp．以aci)、黄瓜灰霉病(置clnerea)马铃薯晚疫病(Pinfestans)等具有不同程度防生物测定，结果表明。以l，4-萘醌为母核，C．5或C．8位加羟基抗菌活性无明显变化；C2或甲基取代则抗菌活性丧失；但保留C-2羟基，C．3位上有亲脂性基团能够使抗菌活性得以一定的保留，说明亲脂性的侧链对抗菌活性有贡献，前提是亲脂性基团logp值在2．5-4之间，芳香类的侧链或相对大的基团会使活性完全丧失。蒽醌类化合物大黄素、l，8·二羟墓葸醌有一定的抗菌活性，1964)，对爱氏腹水癌细胞的影响是强烈抑制呼吸和酵解(陈琼华甜a／．1980)，是～体电子传递系统的抑制剂(陈琼华et口f．1987)。但蒽醌衍生物对植物病原菌的作用机制研究甚少·植物eotiscaiesia的叶部甲醇提取物能够诱导多种作物的抗病性(emt／．9)。最近在该植物中发现了大黄素甲醚之外另一活性组分大黄紊甲醚苷。试验显示至少～植物抗病激活剂(plantactivator)导植物产生具有广谱性、持久性和滞后性的抗病性能。具有如下特诱害的侵袭：(2)生的抗瘸性存在滞后性；(5)不会对病原菌有选择压，不易产生抗药性；(6)对不具有致病的腐生菌、颉颃菌无影响，有利于维持生态平衡和环境保护(范志金甜a／．2005)植物抗病激活荆根据来源分为生物源和非生物源两类。生物源植物抗病激活剂有蛋白类(harpin蛋白)和寡糖类(寡聚葡萄糖)及糖蛋白类(从酵母的反转录酶中获得的糖肽)等。已经报道的非生物源抗病激活剂有内源的乙烯(Et)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和一氧化氮(No)，外源的苯并噻二唑(BTH)、DL．-J3．氨基J4酸(BABA)、2，6-二氯异烟酸(INA)及其甲酯烯丙异噻唑(probenazele)、2,2--．氯一3，3-二甲基环丙羧醑(DDCC)、N-氰甲基．2．(NCI)、水杨酸甲酗(MeSA)、茉莉酸甲酯(MJ)和乙膦铝、磷烯丙异噻唑(probenazele)、2,2--．氯一3，3-二甲基环丙羧醑(DDCC)、N-氰甲基．2．(NCI)、水杨酸甲酗(MeSA)、茉莉酸甲酯(MJ)和乙膦铝、磷酸1PO+)、草酸盐、2,4-D、NAA、M．A，环丙烷、十二烯醣盐酸及一些化学除草剂氟乐灵、甲磺乐灵、仲丁灵等2∞3．Mitohollefdteta／．2002,Go'口胞壁限制了营养物从寄主向病原菌的扩散；木质素前体本身可能对病原菌有毒或通过附着在细胞物的拮抗剂，抑制孢子萌发和菌丝生长，有时还可抑制和钝化病原菌产生的毒素和酶活性(王华甜以2000)。诱导物处理植物后过氧化物酶、多酚氧化酶、苯并氨酸解氨酶和几丁质酶活性增加，苯并氨酸解氨酶是木质素和酚类化合物合成的关键酶和限速酶，当植物被诱导后活性明显增强，与木质素含量增加趋势相吻合，并与诱导抗性表达存在相关性(来经元etaL1999物保卫素(Phytoalexin)的合成与积累：受到病原菌侵染或激发子刺激后所产生或积累的一类菌性次生代谢物，对属于黄酮类、类萜、呋喃香豆素、聚乙炔和葡糖萤类化合物(王金生1995)．病程相关蛋白：在健康植株中不存在或表现微弱，当放不同的诱导因子诱导时迅速产生积累的报道：水杨酸(SA)主要激活了PR-I、PR-2(13-1，3．葡聚糖)、PR-5(thaummin-protein)PR4基冈的表达；活化醣(811-1)激活了PR-I、PR-2、PR-5、PRl0基因的表达；荣莉酸甲酯激活了PR-3、PR-4、PDFi．2的表达；乙烯利(Ethylene)激活了PR-3，PR4(儿丁质酶)和的表达eta／．，1994)；内源信号分子SA、JA、Et和NO进行的抗病信号传导途径的活eta／．1997，Ton甜a1．2002)；已经证实水杨酸在植物抗性反应和诱导抗性信号传级联中是一种内源信号分子，其与植物体内一种同源II型过氧化氢酶基因(C越2Nt)结合，形了水杨酸的生物学靶标蛋白质(酶)，这种蛋白质在诱导抗性中起重要作用，另由研究发现，细胞壁结合的受体激酶(Walk)参与了诱导抗性的信号传递(董合忠etaL2002)。Walld基因诱导死亡。水杨酸对细胞内生理生化反应的调控可能是通过肌醇磷脂信号系统的介导来完成的．水杨酸在信号传导过程中所起的作用，可能是一种电子供体，为过氧化氢酶的过氧化提供电子，使水杨酸变成氧化态的水杨酸自由基，同时抑制过氧化氢酶的活性，产生水杨酸．这可能涉及水杨酸4．研究目本研究小组已经从63种植物中以不同提取方式获得T73黄瓜灰霉病菌进行了较为系统的生物活性测定，以期筛选获得无公害杀菌荆或其先导化合物。菊科的牛蒡、苍耳，茄科的辣椒，十字花科的芥、莱菔，豆科的决明，蓼科的羊蹄、土大黄、大黄，第一第一章文献综中，药用大黄、巴天酸模和土大黄提取物的保护和治疗活性均较明显，具有较大的开发潜力(喻大昭daL2004a，2004b)。本项研究是在此基础上，对其主要活性物质进行进一步的分离和纯化，明确植物源蒽醌衍生物对主要的农作物病原真菌在生物活性，阐明蒽醌衍生物构效关系及其作用第二章天然蒽醌化合物的分离纯化。结构鉴定和生物话第二章天然葸醌化合物的分离纯第二章天然蒽醌化合物的分离纯化。结构鉴定和生物话第二章天然葸醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活1．1．1供试檀所张朝成副研究员鉴定显微熔点测定仪，温度计来校正；BrukerAC-80型核磁共振仪，DMSO和CDCI，为溶为内标；Waters公司2696型液质连用仪，CISSunFireTM的C18柱150mm相乙腈：水=20：80，质谱Quattromicr01’MAPl型；层析用硅胶和检测用薄层板为青岛海洋化工厂出品，硅胶100～160mesh，薄层板0．25mm，510缩得总浸膏829、浸膏339、浸膏D71g，剩余部分899；巴天酸模分别得浸膏F569、G779、H409、1659，剩余甲醇洗脱为mesh硅胶柱层析，以石油醚(60-90℃)：乙酸乙醑=30：1-2进行梯度洗脱，每200mL流分收集I份，根据薄层板点样监测结果，合并相同流分．依次得到流分12-40得化合物1(50mg，采用乙酸乙酯重结晶)、流分45-65得化合物11(42mg10g’用同样的方法依次到：流分10,,34的化合物V(47mg，采用乙酸乙酯重结晶)，流分40-58的化合物V1(38的化合物VIll(28mg，采用甲醇．氯仿重结晶)(流程图见图2．1)第二章天然葸醌化合物第二章天然葸醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活田2-I天然产物提取、分膏、纯化渲程Figure2-1Theprocedureofextract,isolationandpuration1．1．4活性成份的结构鉴将上述8个组分采用薄层板点板分析，发现I和V、II和Ⅵ、IV和Vi两相展开的Rf同(1和V0．4，Ⅱ和VI：O．53，V和I：O．2)，得到5个化合物。为了便于生物活性测定和测定化学结构，代号统一编为：I(代表IV)，2(代表If)，3(代表lid，6(代表I)，7(代表VIII)CDl3或DMSO在液质联用仪上测定紫外吸收和分子量1．2．1植物租提物的活性测药用大黄乙醇租提物的田问防治效果评价将乙醇的提取物，在田阃以黄瓜白粉病和番茄灰霉病为靶标，评价含上述化合物的植物提取物的田问防治效果。黄瓜白粉病防治试验于2005年lO—11月、2006年5~6月分别在武昌和襄樊进行；番茄灰霉病试验于2006年在武昌进行。试验地常规栽培管理，试验前后未施用其他杀菌剂。小区面积均为20m24自粉病以15％Z唑酮可湿性粉剂(江苏建湖县农药厂生产)作对照。番茄灰霉病以40％嘧霉胺可37--10d施第2次药。第2次药后15d调查病情，根据‘田间药效试验准则(一)'操作规程评价药效活性追踪将石油醛、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取药用大黄和巴天酸模的浸膏分别测定第二章天然蒽醌化合物的分离纯化、结构第二章天然蒽醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物话栽条件下对大麦白粉病的防治效果，以确定活性物质在提取物的哪一段．然后进一步分离纯化得单体化合物。活性测定方法为：培养大麦苗至一叶一心。在微量喷雾塔内喷施以上各样品的释液3ml，设喷清水和与处理相同量的DMSO+吐温20水溶液分别作空白对照和阴性对照．以清16h-d)培养。接种后 d记载叶片上孢子堆数，计算每叶平均孢子堆数和保护效果，每处理3次1．2．2植物单体化合物的活性测供试槛袖病原真菌1种。均为湖北省农科院植保土肥研究所植物病理研究室提供(见表O工供试化合物共计7个化合物(见表2-6)，分别为分离纯化获得的5个化合物，从北京化学剂公司获得的茜素，从中国生物制品鉴定所获得的1，8-二羟基蒽醌。将化合物分别溶解在中(ImgmL4)作为母液，用蒸馏水稀释，吐温20作为乳化荆和展着剂，最终的浓度250PgmL"1．化合物的试验浓度均为10PgmL"。和40PgmL"1et口f．2001)。将1．2．1的活性追踪方法。稻瘟病菌：分生孢子在番茄燕麦汁培养基上获得250lgm．I205lmL用手持喷雾器将孢予悬浮液喷接在旌过药的大麦植株上，在饱和湿度和26士0．5℃下避光培养36h后见光培养，相对湿度约90％．接种后约120h，空白对照充分发病，调查单叶片病斑数，计算每叶平均病斑数和防治效果．防治效果(％)t(空白对照每叶病斑数一处理每叶病斑数对照每叶病斑数x100％d，最适合条件视菌离体测试：将供试菌株接种于PDA平扳中部，在23--28℃下培养而异；用直径为6ram的打孔器沿菌落外缘制成菌饼备用。将供试化合物溶液分别配制成100mLl和400PgmL‘，然后将溶液与PDA培养基按1：9体积比混合均匀后(即稀释lO倍)，制成直径为90mnl不含供试化合物的PDA平板和含与供试化合物溶液相同量的DMSO+吐温20分别作空白mm)，用照和阴性对照，以消除溶剂的影响．待空白对照处理菌丝充分生长后(直径接近标卡尺十字交叉法测定各处理菌落直径(mm)，计算抑菌效果．抑菌效果％=(对照菌落直径处理菌落直径)，(对照菌落直径一菌饼直径)×1000,6第二章天然葸醌化台物的分离纯化、结构鉴定和生物活囊2．1供试真■一Table2-1Yunplspeciesusedin病原代病害通用勘靠，恤ci艇￡!!噬多种植第二章天然葸醌化台物的分离纯化、结构鉴定和生物活囊2．1供试真■一Table2-1Yunplspeciesusedin病原代病害通用勘靠，恤ci艇￡!!噬多种植ol斜灰霉Vm'ious菌核病油菜OilA／ternar／a加ta(Fires)Keiss炭疽病烟草A毫辣椒赤霉病禾谷樊Fu口NightbloomingcⅢs轮纹病Applering叩南苹果小麦Rkizoctonia钾陀dbVaadcr纹枯病Sharp对B软腐病甘薯sweet臼粉病PowdefyBlumeriagramlnis(Dc)EOSpoor型堡磐业逝f卫旦幽2盟大麦融时坚2．1结构鉴化合物I(大黄酚，chrysoplⅧmol，3-甲基一l，8--"羟基葸醌)：黄色结晶，m．P．195～196℃， 信号，为蒽醌化合物的羰基典型信号ppm处有2第二章天然蒽醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活 第二章天然蒽醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活 桔红色针状结晶，m．p．198^-199"C，分子式为C17H140s．UV^。一223．5，280．5，425．5，El-2．42(3H，s，CHD。oCH，)，6．75(1H，d，J=2．5Hz，7．H)，7．OS(1H，b7．55(1H，b略。伸)，13．07(1H，s，OH)．‘3C-NMR在为蒽醌化合物的羰基典型信号化合物1V(大黄素，em04in，3-甲基．1，6,8-=羟基蒽醌)：橙黄色针状结晶。m．P．25．％-分子式为CisHi005．uVk“．221．5，287．5，440．5，EI-MStn，z：271．1(M+)．。 d，J---3Hz，2-H)，7．80(IH，d，J=3Hz，4-H)。12肿(IH，brs，6-OH)，12．10(1H。ppm范围内有4个叔碳，8个季碳信号，这是羟基蒽醌的典型信号为CisHs06．UVk。：228．5，257．5。430．5，El-MSm／z：285．1(M+)．1HNMR(DMSO-5．8．14(1H，d，．卢1．5Hz，H-4)，7．81(1H。t，j-7．7。8．2Hz，H-6)，7．78(IH，d。J=1．5Hz，H．2)，7．75(1H，d，J--7．5Hz，H-5)，7．42(IH，d．J-8．3Hz，H-7)，12．06(a-OH)．1℃小啦HH曲H：CcOO啊2-2供试■■化合鞠的化学结Figure1-2ThclNmical柚mct_n1．2．1檀物粗提物的生物活性测药用大黄乙醇租提物的田问防治效果在田间的试验表明，药用大黄乙醇的提取g)防治白粉病、70％嘧霉胺第二章天然蒽醌化台物的分离纯化，结构鉴定和生物活分散粒剂稀释第二章天然蒽醌化台物的分离纯化，结构鉴定和生物活分散粒剂稀释1000倍(609)的防效相当(见表2．2和2-囊2．2萄用大冀的扭取物对黄瓜白棚的田闫防治效果囊2-3大黄的攫取铀对番茄灰霉病的田问防治效活性追踪采用大麦白粉病菌对药用大黄和巴天酸模的分离物进行活性追踪。第1到的浸膏分别稀释1000倍，采用1．2．2的活体测试方法测定对大麦自粉病的生物活性。发现氯仿段B或G的防治活性展高，其他部分的活性较低，因此确定氯仿浸青进行下一步分离纯化确定活性物质(见表2-4)：将氯仿浸膏进行分离、重结晶后稀释10000倍对小麦白粉病菌的生物活性寰2_4药用大黄和巴天鼍横的分膏物稀释1000倍对大蠹白糖病■的防治效Talde2-ABCE"m强"GFHJ鳍鸵帕D加b第二章天然葸醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活襄2_5药用大量和巴天鼍第二章天然葸醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活襄2_5药用大量和巴天鼍横的分膏袖嚣■10(100蕾对大蠢白糖囊■鼓防治效珊IU"柏ⅥV葸醌化合物对11个供试植物病原真菌的生物活性测定结果见表2-6和图2-3和在活体条件下，3个蒽醌类衍生物大黄素甲醚、大黄素．1,6-zepmL"’时大黄较高的活性，在40pgmL"’时的防效分别为99％，97％和98％，在lO大黄q1醚lO¨gmL"’时防效为97％和92％的防效，但大黄酚的防效仅5％。同时上述个化合物对稻瘟病也表现较高的活性，在40PgmL"’时的防效分别为80％、82％和70％，在mL"1时大黄素甲醚和大黄素一1,6---甲醚的防效为54％和44％，但犬黄酚lO有9％1极性较高(含羟基较多或羧基：大黄酸，大黄素、1,8-二羟基葸醌和茜素)的蒽醌衍生物的活性．在离体条件下。供试蒽醌类化合物对供试的9个菌的活性并不高。仅大黄酸对黄瓜灰霉3讨对植物病原真菌的活性中起主导作极性较低(大黄素．I，6．二甲醚、大黄酚、大黄素甲醚)的葸醌衍生物在植株上对病原菌的生物活性。明显优于极性较高(含羟基较多或羧基)的蒽醌衍生物，如大黄酸、大黄素、l，8-二羟基蒽醌和茜素的活性。这可能是极性较低的蒽醌衍生物有着比极性较高的衍生物更适合被植物胞吸收，从而对入侵的病原菌产生作极性较高(含羟基较多或羧基)的蒽醌衍生物，如大黄酸、大黄素、1，s．二羟基葸醌和茜素对病原的直接抑菌作用要优于极性较低(大黄素一l，6-二甲醚、大黄酚、大黄素甲醚)的蒽醌衍生物．这可能是因为在离体条件下(含药培养基)极性更高的葸醌衍生物含有的羟基和羧基等亲水基第二章天然葸第二章天然葸醌化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活药用大黄乙醇的提取物，对黄瓜白粉病和番茄灰霉病菌具有良好的防治效果．其稀释100和250倍的防效分别与对照药剂15％三睦酮可湿性粉嗣稀释1000倍防治白粉病、70％嘧霉胺一Nm一嘈N卅n■N喇nnn■n*nⅢn州onn书n，喇H州●制onn*n■拿nm●■一卅n书蜀H十N■n*H卅。n十上H■上28．—●。。。尊鲁。。。。。。noon*n书H坩一Nm一嘈N卅n■N喇nnn■n*nⅢn州onn书n，喇H州●制onn*n■拿nm●■一卅n书蜀H十N■n*H卅。n十上H■上28．—●。。。尊鲁。。。。。。noon*n书H坩。ii一一-·一善七高-H。。。。。。。未苫鲞。Iiii惫．^2oi；。。。。曼a i乞i2j掣蜒嚣州巽心辅霉好，晕蒙键容g释如摹醒锄群K摒■孵nn—々未：：茎。墨盏。。。。兰I薯罟nJ葛uI晶■嚣善Ⅱlj口是葺苫tJ々扫l^弓一妄--；。。锄9-Hi翟益■杈错掣扑二1壁扑<刳《哑壬霉如，富暑薏目—々-9．_一§qcl0∞昏6．蚤善^4wp-∞．一砸!I『m。th_口n40nlgL-稻瘟病MagnaportheL-40nlgL-稻瘟病MagnaportheL-洼No协：1--emed抽，2--phyd,m，3一l—dm咖●o研—m础n·4一妇咖，5一I^棚崎m嘲哼柚曲nqm呻辨，6--daTmphanet·7一中国农业大中国农业大学博L学位论第．章天然总醒化合物的分离纯化，结构鉴定和牛物活田2-4墓蠢衍生麓对9种檀物病原真■的抑曹活生，I-大羹t。2--大冀●单一。3一大冀●-1,6--甲18，4-蕾囊，S--hS---羟tt■，6一大姗。7一大曩^‘咖1--modll·2--pl撺tou，3--1㈨-emoauP4--sdimdn,5一l，枷dm酵蛐曲r_—h噼，6一曲町M—哪IoI，7--rl岫第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病菌活性的增效作第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病菌活性的增效作由最fidig／nea引起的黄瓜白粉病和且gram／n／s大范围严重减产eta／．1996，AskaD,eta／．_1997)。施用大量化学 使用大黄素甲醚和大黄酚是存在于植物Fab∞e∞(Ca目／aspp．)，Polygonaccae(Rhewn，mMPolygonumspp．)和Rhammlcene(Rhamnus和Ventilagospp．)中的天然蒽醌类化合物，可以从些植物的根部以柱层析等色谱方法提取和分离获得(李建北＆林茂￡sp．odMrhd)，黄瓜白粉菌，水稻纹枯病菌(RicoaonKhn)，灰霉病菌(且“Pe：s)和黄瓜霜霉病菌(Peudopronspracubnsideary)(hoita／．2004)。在我们先前的黄瓜弁粉病菌的生物活性测定试验中，主要含有人黄素甲醚和大黄酚的植物提取物在同等剂量时的活性优于两个单体化合物的活性，显示两者存在时有潜在的增效作用。为了．证实这个现象的大黄素甲醚(纯度98％)和大黄酚(纯度9S％)对照品从国家医药和生物制品检定所获得．含有大黄素甲醚和大黄酚的植物提取物的制各；根据优化了的陈琼的方法，制备用于温验的植物提取物(Cherteta／．2001)。将大黄的根磨碎，采用20％H2S04+氯仿(1+5体积水浴中回流3h，氯仿相先用0．25％氢氧化钾水溶液萃取，然后有机相用5醚和大黄酚在薄层板上(硅胶mesh。0．25nun)的Rf值分别为0．74和0．53，油醚+乙酸乙酯(15+l体积)。根据气象色谱分析结果，该植物提取物中大黄素甲醚和大黄mm以25oCvain"1升温到230"C，再以20ocmin"‘升温到290oc并持续15rain．进样和检测温度min和23．50为2500C，进样体积为2¨L。大黄素甲醚和大黄酚的保留时间分别为第三章丈黄素甲醚和大黄酚对自粉病和小麦白粉病菌(置gram黄瓜白粉病菌RH，16h的光周期第三章丈黄素甲醚和大黄酚对自粉病和小麦白粉病菌(置gram黄瓜白粉病菌RH，16h的光周期。小麦白粉病菌的培养条件为IS4-IoC连续光照。当大量的分生孢子形成时，赢接作为接种体感病黄瓜品种长春密刺。播种在直径为200mm盛有丰富腐殖质土壤的塑料钵中．在温室生长3q周后。将第4片真叶离体，用蒸馏水冲洗和纸巾吸干后，以打孔器制成直径为15的叶圆片．每6个叶圆片摆在1个盛有n'fffl的培养皿中备用。感病mL水琼脂、直径为麦品种郑93播种在直径为200m盛有丰富腐殖质土壤的塑科钵中。在光照培养箱(18主70％RH和连续光照每5段叶片摆在1个盛有20mL水琼脂、直径为90mm的培养皿中备大黄素甲醚、大黄素甲醚和大黄酚的复合物(9：l，8：2，7：3，6：4．5：5，4：6，3：7，2：8，and以10,2．5，0．63，O．15和0．04PgmL"1的剂量施用，大黄酚以PgmL"‘的剂用80在溶液中的最终浓度为0．025％(v／v)．喷雾采用自动喷雾塔，喷压为0．25[V[PaPWT-510)，喷雾量为 mLm-2。根据预备试验结果，阴性对照和空白对照无显著差异，因此采用性对照作为此试验的对迅速盖上皿盏后在黑暗中保湿培养(25士loc)，24h后移到16h麦叶段在接种塔中接种，接种量800～1000分生孢子／cm2，然后放置在18．4-Ioc和连续光照的养箱中培养防效％=100×(空白对照一处理)／空白对照mL"‘，采用手持喷雾器喷雾．量均为IOmgmL-l，天然提取物的施用剂量为10，2．5和0．63阴性对照为对照，施药24h小麦品种郑98播种在直径为200mm的塑料钵，每钵14株，于温室中培养(约14-22。C)。当二叶充分展开时，采用洗耳球将分生孢子吹接到植株上。接种后d情：0无病；l病斑面积占叶片面积5％以下；3病斑面积占叶片面积6--15％；5斑面积占叶面积16--25％：7斑面积占叶片面积26-50％；9斑面积占叶片面积超过51％中国农业大学博上第三章丈黄素甲醚和大黄酚对白粉病感病黄瓜中国农业大学博上第三章丈黄素甲醚和大黄酚对白粉病感病黄瓜品种长春密刺，播种在直径为200inln盛有丰富腐殖质土壤的塑料钵中，每钵(2×l旷分生孢子mL"1)。接种后14d调查叶片上白粉病菌落数。试验为随机区组设计，4次10．0软件；大黄素甲醚、大黄酚和组合物的EC舶根据Gisi的方法剂量一反应回归采用根据如下公式计算理论A和B分别代表大黄素甲醚和大黄酚；a，b大黄素甲醚和大黄酚相互作用的类型根据如下公式Ec50油，是根据观察值计算出来的EC50值。如果R值不显著高-f-i．0(O．扣1．5)，表示加性作用如果R值高于1．5表明增效作用：如果R值低于0．5，表明减效作用(Gisi温室试验的数据采用变量分析，平均值的比较根据Dunc．an’s多重比较2结从两次独立的试验中获得类似的结果(见表3．1和表3-2)．大黄素甲醚显著高于大黄酚对白病菌的活性。对于小麦白粉病菌，丈黄素甲醚和丈黄酚组合物的R值(理论EC√观察EC∞两者含量的变化为0．99~2．78，对于黄瓜白粉病菌，大黄素甲醚和大黄酚组合物的R值(理论√0O．(在组合物中的比率为6：4"-9：1i：9～5：5时，则表现为增效作用．增效水平随着大黄酚在组合物中的比率的增高而升高采用天然组合物剂量为0．63一mUl时，小麦植株菌落数显著低于大黄酚在剂量为pg，mL的病情：天然产物剂量为10病情严重度和黄瓜叶片上的白粉病菌落数与大黄素甲醚表3．)。这表明大黄素甲醚和天然组合物比大黄酚对自粉病具有更高的活性．天然组合物了存在与大黄素甲醚和大黄酚间的增效作用第三章大黄素甲醛和大黄酚对自粉病菌的增效作囊3-1大羹囊甲t，大黄■和天然曩台■在童内对小蠹自硼的生栩11K受鲤!鲤恻垡＆虫塑i墅塑④堡丝!塑鲤!Q!塑翌鲤i墅!丝一0．14(0．12一一a螂∞供Ⅲ，．1914．40-一一一一Combination0．1610．14-0．1研CombinationCombhutionCombinationCombin砒0．24r0．21-第三章大黄素甲醛和大黄酚对自粉病菌的增效作囊3-1大羹囊甲t，大黄■和天然曩台■在童内对小蠹自硼的生栩11K受鲤!鲤恻垡＆虫塑i墅塑④堡丝!塑鲤!Q!塑翌鲤i墅!丝一0．14(0．12一一a螂∞供Ⅲ，．1914．40-一一一一Combination0．1610．14-0．1研CombinationCombhutionCombinationCombin砒0．24r0．21-0．25fo．22-垒婴§也苎i婴ratioofcoml，i--．ationshphyscmtodaysoplmd”TheratioofthⅢreticalECsotoolamved虻裹3-2大黄素甲蠢、大黄酚和天然混合物在室内对黄瓜自粉病的生物活性一Table3-2．Thefungicidalaetivlties／n讷andtheircombinationsoR吧趔!空巴!!坐!i苎生￡!§皂11lcfirstt1hcsecond婴a(雌虫芝墅!!塑i 0．24f0．21-一一一一一一一Combination0CombinationCombination0．28m．2A-Combination1．II．o．7．0．42《0．37-o．39(0．35-2：Q：竺i!：!!生：丝1：第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病囊3-3大第三章大黄素甲醚和大黄酚对白粉病囊3-3大奠蠢甲奠，大黄醴和天然混合铀在噩童条件下对小囊白糟痹的防效比Table3-3EHectsofphysCion。chrysophmlolendtheirnaturalextract¨plantpowderymildewInDiseasecolonies伽cucmnbi型幽Disa钟hKk-xFirst注·同一栏中相同标有字母的数据在0胁东平无显薯差异#··大黄素甲蕞与大黄酚JfL之-比为笠t竹Note：*Meanswithin^∞II时mfollowedbytheI蚰tl眈时舯notIi驯fi铷嘶di伍erenlat，=005mragoofphymond_叩0p岫3讨([zhaki202)cnae(ChieLL1995，作用我们先前的研究发现主要含有大黄索甲醚和大黄酚组分的大黄提取物(足面钯i砌如)对植物白粉病的生物活性随着批次的不同有所变化(数据为列出)。目前的结果显示这种变化是由于这两种活性成分在不同批次中的比率不同造成。两种组分比率的变化导致不同的增效程度，和不第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基线第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基线第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基线研n1．1996,Shid以2002)．抗病品种全球性病害(kabl印＆b山l锄ty脯1963，Khan1970，黜狮推广旅用不能完全取代生产上对化学农药的需求(Mcormh甜以1996)。使用合成化学农药舫治病害 eta／．2004,Kim“a／．2004)。这类农药不仅有较为广泛的杀菌谱而且容易生物降解，对环境友好et根据我们和其他研究小组的研究结果，大黄(包括足officinalFBaill,兄胛砌础ⅢL．，tanguticumMax：nnRegel．足emodi,置erispusL．，尼laciniaturaPralll等)的乙醇提取物，能够在温室和大田防泊黄瓜、小麦和大麦白粉病(嗡大昭eta／．2004，Choi“a／．2004)．Bary)(蒋继志＆梁宁2005)，番茄灰霉病(Botrytiscinerea)，小麦条锈病稻瘟病(Magnaporthe神∞)(Cl∞i甜K￡thn2004)，草莓根腐病ColetorchmleopoiidscrE)(蒋继志et娃2001)，辣椒和番茄病毒病等(Zhu＆Chiu1989；Guoeta／．1998)。此外，植物ReynoutriasachalinensisP}．的提取物，含有一种重要的蒽醌类活性成分犬黄素甲醚，在1990年l扫CompoGmbH(MOnster,Germany)公司昂早商业化为可湿性粉laflasig)HergerKlingauf,Daafyet口王1995．Konslanlinidou-Doltsiniseta／．2006)，同时对灰霉病和烟草花叶病也有效d1996，Fritz1996)saehalinensis的叶分离到系列蒽醌类化合物。并且证实他们对靶标植物病原菌有生物话性1990,Kimefa／．2004。ChoietaI．2004。Konstanfinidou-Doltsiniseta1．2006。Yueta／,2001，Kim“a／．2004，Choi“a／．2004)。杀菌剂的抗药性已经成为化学药剂防治病害的严重问题。20世纪90年代开发的具有新型作机制的丙烯酸酯类杀菌剂能有效的防治对麦角甾醇抑制剂、生物合成抑制剂和脱甲基抑制剂类菌荆有抗药性的病害(Margot甜以1998)．然而，由于丈量和不合理的使用，作物病原菌对烯酸酯类的抗药性很快就产生了1999,Ishiieta／,2001，Margot甜a／．1998杀菌剂对靶标病原菌的敏感墓线(应该在该杀菌剂推广使甩之前，Justumet以1998)对于评估抗目前大黄根的乙醇提取物在中国正在开发为防治黄瓜白粉病和霜霉病的植物源杀菌剂(Veguardo,0．5％大黄素甲醚水剂，北京清源保生物科技有限公司)。从2004年到2006年两年八的一种重要活性成分，在本文作为供试化合物来测定2004-2006中国农业大学博上第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基线的敏感基线。同时，实验室条件下测定了黄瓜白粉病菌XZ4中国农业大学博上第四章大黄素甲醚对白粉菌和霜霉菌的敏感基线的敏感基线。同时，实验室条件下测定了黄瓜白粉病菌XZ4基亚枫(DMSO)为母液，避光保存在40Cmg大黄素甲醚溶于2004～2005年黄瓜生长季节，在包括北京、武昌、郑州，南京、天津、孝感、荆州、成都和长沙等9个地区的温室和大田采集感染白粉病和霜霉瘸的标样，每个地区采集ll《7叶分别用塑料代保存，叶柄包上湿棉球黄瓜自粉病标样放在254-loC、12h光周期的光照培养箱中，2d后用分生孢子转移到健康新鲜的黄瓜子叶上繁殖。接种后的黄瓜子叶放进盛有2％水琼脂的培养皿上皿盖后置光照培养箱培养至产孢黄瓜霜霉病标样在184-IoC保湿避光培养12h诱导产孢。采用微量移液器用无菌水将黄瓜105分生孢子mL"1)，吐温20的浓度为0．025％(v／v)，然后孢子悬浮液用双层镜头纸过滤同样，供试黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液(约 10'孢子囊mL"1)也按此法制备大黄素甲醚系列剂量10．0、2．5、0．63，0．15和P．gmL"1用于黄瓜白粉病菌的Ec∞测定，系剂量12．5、3．125、0．78、O．19和最终浓度为0．025％(v／v)。根据预备试验结果，阴性对照和空白对照的病情没有显著差异，而设阴性对照为试验对照对于白粉病测定，采用自动喷雾塔(O．25MPa。PWT-510)将大黄素甲醚水溶液喷施到叶片上．喷施与大黄素甲醚溶液相当的DMSO+Tween20水溶液作为阴性对照，喷雾量为25mlm-2。药液阴干后，将黄瓜子叶剪下摆放在盛有2％水琼脂直径为60mm的培养皿中，每皿摆放3片叶。用手持喷雾器喷施自粉菌孢予悬浮液进行叶面接种，叶面水珠阴干后盖上皿盖，在25．4-I。C条件16h。采用透明胶带将子叶表面的孢子取样后放在事先滴加0，1mL油混合(乳酸坩油，水=1／2／1，v／v／v)的载波片上，盖上盖玻片在第四章大黄素甲醛对白粉菌和霜霉菌的敏感基线抑制率(％)=f(对照发芽率一处理发第四章大黄素甲醛对白粉菌和霜霉菌的敏感基线抑制率(％)=f(对照发芽率一处理发芽率)，对照发芽事】采用叶臻法测定霜霉病的敏感基线．在黄瓜5片真叶期将第4片真叶用打孔器制成直径为的叶礤，将叶碟在相应的供试溶液中浸泡5s后摆放在盛有2％水琼脂直径为90mm培养皿，每lS片．待叶碟表面水珠阴干后，用微量移液器取10嵋黄瓜霜霉病孢子囊悬浮液接种在叶臻中央．盖上皿盖后放在184-IoC下避光培养12h，然后转移到18士16C、h光周期的培养箱养．接种后7天目测病斑面积占叶礤面积的百分比，根据Abbott的方法计算防效(Abbott防效(％)t100×【(对照病情一处理病情)，对照病情根据剂量反应曲线计算大黄素甲醚对每个菌株的Ec，o值。采用Kolmogomv-Smimov每个地区EC∞值频度曲线是否符合正态分布，用Kruskal．Wallisl[E间的差异。在年度问、地点问没有显著差异的情况下，将所有的数据合起来计算敏感基线值，分析软件采用将Ec∞值接近敏感基线值的黄瓜白粉菌($．fuliginea)单孢分离菌株Z4作为初始茵株(GO)。将黄瓜子叶用0．829崞m"1的大黄素甲醚溶液处理(该剂量接近ETo值)。然后接种Go的分生孢子，存活下来的分生孢子用作第一代(I)。然后将l接种同样剂量处理过的黄瓜子叶上。存活下来的分生孢子作为第二代(G2)。如此一直进行到第15代(GIS)。对于每一代均采用1．4的值)与大黄素甲醚选择压力代数的相关性年度间和每一样点白粉病菌种群的EC"中值、最小值、最大值、种群大小、变异因子等列0．513，>0．05)，ECho值的变异范围为0．153-4)A54PgmLl，平均值为0．304(士(见图4-1)．9个地区白粉病菌种群的变异因子的变化范围是1