cyp2c19基因多态性在氯吡格雷抵抗患者中的筛查与分析

cyp2c19基因多态性在氯吡格雷抵抗患者中的筛查与分析

氯吡咯（cpg）是碳水化合物（adp）的受体抑制剂。这是目前临床应用最广泛的抗血小板聚集药物之一。它是一种未经处理的疲劳药物。由于CPG药效明确、毒副作用小,很快就获得市场的好评。但临床上常有使用CPG后无效的案例报道,尽管药物有个体差异,但此类报道还是引起了临床的重视。大量的体外实验结果证实,个体对CPG的反应存在较大差异,尽管长期服用常规剂量的CPG,但临床上仍有4%~30%的患者在24h内不能有效防止血栓事件发生,且其血小板功能检测证实,血小板聚集不能被有效抑制,这种现象被称为CPG抵抗,亦称为CPG无反应、CPG低反应等。由于CYP2C19酶参与CPG的体内代谢,其多种基因型的表达直接影响CPG的药效,且存在个体、地域、民族之间的差异。所以,本研究对喀什地区某三甲医院心脑血管疾病患者的CYP2C19基因进行初步筛选,探讨临床药师如何对CPG抵抗患者开展药学监护,进行个体化给药,以提高用药安全性,减少无效用药事件的发生。1材料和方法1.1心血管疾病病例的血缘关系选取2011年5月—2013年7月喀什地区某三甲医院住院并经CPG治疗的心脑血管疾病患者1020例,无血缘关系,排除严重心功能不全、肝肾疾病者;其中,汉族220例,维吾尔族800例。1.2pcr扩增及评定血液基因组脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒、基因检测试剂盒、杂交显色试剂盒(上海百傲公司);line-gene9640型PCR扩增仪(杭州博日公司);BaioR-Hyb型全自动杂交仪、BaioRBE-2.0型生物芯片识读仪(上海百傲公司);Smartspec3000紫外分光光度计(美国BIORAO公司)。1.3代谢表型的基因型根据CYP2C19基因代谢表型具有的基因多态性将其分为3组:代谢表型属强代谢型纯合子(EMhomo)的基因型为*1/*1;代谢表型属强代谢型杂合子(EMhete)的基因型为*1/*2、*1/*3;代谢表型属弱代谢型(PM)的基因型为*2/*2、*2/*3及*3/*3者。1.4方法1.4.1基因组dna的提取取外周静脉血2ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,按照试剂盒的说明流程提取基因组DNA。紫外分光光度计检测提取到的DNA的浓度和纯度,DNA的浓度应达到10~60ng/μl,260和280nm处的吸光度比值应为1.5~2.0。1.4.2cyp2c19扩增液及条件设置每份样品检测需要扩增2个位点(即636G/A、681G/A)。PCR扩增体系如下:反应体系为:基因组DNA5μl,CYP2C19扩增液1或扩增液219μl,反应液A1μl,总体积25μl;扩增液中含生物素残基标记的引物。设置阳性对照和阴性对照,与标本一起扩增。扩增条件均为:50℃5min,94℃5min,94℃25s,48℃40s,72℃30s,35个循环;72℃5min;扩增产物2~8℃保存。1.4.3抗磷酸酶标记亲和素溶液b.条件取CYP2C19预杂交液1200μl;杂交反应液200μl(180μl杂交缓冲液+10μl扩增产物1+10μlCYP2C19扩增产物2);洗液A800μl;洗液B1600μl;洗液C400μl;抗体液200μl(含有碱性磷酸酶标记的亲和素);显色液(BCIP/NBT)。杂交舱内放入预杂交液,42℃5min,吸除舱中溶液;舱内放入杂交液,基因芯片迅速放入,42℃30min,吸除舱中溶液;舱内加入洗液A,42℃6min,吸除舱中溶液,重复1次;舱内加入抗体液,室温20min,吸除舱中溶液;舱内加入洗液B,室温5min,吸除舱中溶液,重复1次;舱内加入洗液C,室温3min,吸除舱中溶液,重复1次;舱中加入显色液,42℃30min,吸除舱中溶液;将基因芯片用蒸馏水冲洗,烘干。1.4.4图像扫描与数据分析将基因芯片放入生物芯片识读仪,用百傲基因芯片图像分析软件进行图像扫描与数据分析,输出检测结果。每次实验设置阳性对照(CYP2C19*1/*3)和阴性对照(空白),以起到对每次实验结果的质控作用。1.5个民族间基因表达频率比较用SPSS17.0软件进行统计学处理,2个民族间基因表达频率比较采用χ2检验,检验水准取α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。2不同cyp2c19代谢的药物治疗对超越用药人群的影响筛查结果见表1。如表1所示,维吾尔族受试人群EMhomo分布显著高于汉族受试人群,PM频率分布显著低于汉族受试人群,差异有统计学意义(P<0.01),可认为维吾尔族患者更适合使用经CYP2C19代谢的药物CPG治疗,其发生CPG抵抗的概率更低,疗效更好;汉族患者与维吾尔族患者比较,更易受到CYP2C19基因多态性的影响,提示今后更应对汉族患者使用经CYP2C19代谢的药物CPG时进行个体化给药,开展药学监护。3讨论3.1cpg阻力的原因3.1.1cpg治疗的原则导致CPG抵抗主要的外在因素包括:(1)患者的生活习惯,如吸烟、饮酒等。(2)用药剂量:CPG的抗血小板效果存在剂量和时间依赖性,负荷剂量为300mg的CPG经4~24h达到稳态,抑制水平维持在40%~60%;若无负荷剂量,达到稳态则要4~7d。(3)患者用药依从性:关于患者依从性方面的研究报道很少,但依从性欠佳也可能是发生CPG抵抗的原因之一。Hamann等研究发现,长期服用CPG治疗的过程中,冠状动脉疾病患者中断服药率>15%;脑卒中患者中断服药率在3个月时达18.4%,1年后中断服药率高达38.4%,这可能与CPG抵抗的发生相关。(4)药物之间的相互作用:CPG为前药,通过氧化作用形成2-氧基-CPG,再经过水解形成活性代谢物。CYP2C19酶是参与CPG生物转化的重要的酶之一,与CYP2C19酶活性相关的药物如其的诱导剂和抑制剂,都会对CPG作用产生干扰,降低CPG的抗血小板效果。(5)疾病因素:不同类型的冠心病、糖尿病和胰岛素抵抗也会导致CPG抵抗和出血的发生。3.1.2基因突变体cyp2c19基因多态性是发生CPG抵抗的主要遗传基础,肝药酶CYP包括CYPlA2、CYP286、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5,均参与CPG的活化,其中,CYP2C19酶是CPG活化过程的关键酶,编码该酶蛋白的基因CYP2C19在人体内呈多态性表达。目前,研究较多的突变体是CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*4、CYP2C19*5,其中,CYP2C19*2为最主要的突变体。Heehler等对转基因鼠的研究发现,P2Y12受体的过分表达可引起血小板反应性的增加,故可导致CPG的抗血小板疗效降低。这种CPG抵抗存在个体差异,可能是由个体遗传信息的不同或变异所致。而Jessica等的Meta分析结果显示,CYP2C19的功能缺失与临床的不良预后最相关,换言之,携带突变等位基因的患者发生不良反应的风险明显高于非携带者。Hulot等对28例健康男性的研究发现,连续服用CPG75mg、1日1次,7d后CYP2C19*1/*1携带者的血小板聚集率较CYP2C19*2携带者低。3.2cpg阻力的药物监测3.2.1cyp2c19基因型筛查在社区的应用对患者的病例资料进行完善,是临床药师对CPG抵抗开展药学监护的第一步。多年的临床经验,让广大的临床工作者了解到导致CPG抵抗的因素是多方面的,因此,对于患者的生活习惯、疾病史等,都应详细记录,对于有可能产生CPG抵抗因素的患者,应进行重点监护,以预防CPG抵抗的发生。目前,对CPG抵抗密切相关的CYP2C19基因型的检测技术已经非常成熟,主要的筛查方法有流式细胞仪法、快速血小板功能分析仪(VeryfyNow)、血栓弹力图法(TEG)等。在不同地区进行CYP2C19基因筛查的研究结果显示,个体、种族和地域之间的突变基因分布具有较大差异。Paré等研究结果显示,CYP2C19基因多态性只能解释12%的CPG反应差异性,但是,对于基因型的检测可以进行早期预防,积极采取干预措施,避免这部分人群使用CPG而产生CPG抵抗,发生严重的后果。3.2.2临床医生需与患者沟通在全面控制心血管疾病危险因素的同时,临床药师应与患者进行沟通,使患者具有良好的用药依从性,尽可能避免合用能影响CPG疗效的药物。3.2.3加大cpg剂量对一些慢代谢患者人群,将CPG负荷剂量从300mg增至600mg,将CPG的维持剂量从75mg/d增至150mg/d,往往能增加CPG的抗血小板能力。对于存在有影响CPG吸收疾病,如慢性胃炎、消化系统疾病等的患者,在治疗的同时也有必要加大CPG剂量;此外,对于合并高胰岛素血症、胰岛素抵抗及肥胖患者,也有必要加大CPG剂量,同时需加强对患者血糖、体质量的控制,以减少CPG抵抗。3.2.4p2pc19酶的诱导对于有多种疾病的患者,在使用CPG时还需服用其他药物,应尽量避免使用影响CYP3A活性的药物,谨慎使用CYP2C19酶的诱导剂(如巴比妥类、利福平、泼尼松等)和抑制剂(如西咪替丁、酮康唑、吲哚美辛等);质子泵抑制剂奥美拉唑也通过肝药酶CYP同工酶系统代谢,主要为CYP2C19和CYP3A4,与CPG有着相同的代谢途径,二者合用时,奥美拉唑可通过竞争CYP2C19上的相同结合位点,抑制CPG活化,从而减弱CPG抗血小板的效果。3.2.5cyp2c19基因相关安全性的改善美国心脏病学院基金会、美国心脏病学会及美国卒中协会指南指出,存在临床事件高风险的患者需更换治疗药物;在2010年欧洲心脏学会/欧洲心胸外科协会心肌血运重建指南建议中,新型抗血小板药普拉格雷和替格雷洛获得推荐,这两种药物不会因基因多态性而产生血小板抑制作用减弱的现象。普拉格雷属第3代噻吩吡啶类抗血小板药,具有更高的前体药物至活性代谢物转化率以及生物利用度,TRITON-TIMI38的研究结果与谭晓辉等进行的Meta分析结果均表明,普拉格雷在降低心肌梗死和形成血栓的发生率方面,比氯吡格雷具有更显著的优势,且受代谢影响较小;虽然普拉格雷导致出血相关并发症的发生率比氯吡格雷高,但亚组分析结果显示,其发生率增高仅限于年龄>75岁、体质量>60kg以及有卒中史的患者,为了减少不良反应的发生,建议以上3种人群,以及患有活动性病理性出血、短暂性脑缺血发作或需要手术(包括冠状动脉搭桥手术)的患者不要服用此药,可以考虑应用替格雷洛。在2010年ESC会议上公布的PLATO遗传学亚组研究结果显示,与氯吡格雷相比,替格雷洛可使心血管死亡、心肌梗死和卒中组成的主要复合终点相对危险度显著降低16%,同时未增加主要安全