蛋白酶水解鹿血的实验研究

蛋白酶水解鹿血的实验研究

鹿血是鹿动物。它具有抗衰老、提高工作效率、养颜、补铁补血、抗疲劳等多种功能和药用价值1'。多年来,我国对于鹿血资源的利用仅限于对原血液的利用和加工,其中大部分都是以鹿血酒的形式存在［2］。利用酶技术、生物技术以及现代分离技术对鹿血进行开发和利用,对提高产品的附加值,开发具有功能性的活性肽具有重要的理论和实践指导意义。本研究在最适条件下选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶对鹿血进行酶水解,并对其水解度(DH)以及水解物的还原能力和对DPPH自由基的清除能力进行比较,从而优选出最佳水解蛋白酶。1材料和方法1.1中性蛋白酶和风味专利基因试验用梅花鹿血购自平山鹿场;碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶购买于Novo公司;DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)购于Sigma公司;其它试剂均为国产分析纯。1.2仪器和检测方法Delta320型pH计(上海MettlerToledo仪器有限公司);高速离心机TGL-16C(上海安亭科学仪器厂);JD500-2型电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);精密电子天平AB204-N(上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司);紫外可见分光光度计UV-2120PSC(上海优尼科仪器有限公司);电热恒温水浴锅LH586-2(上海精科实业有限公司);精密增力电动搅拌器JJ-1(浙江金坛市通济电器有限公司)。1.3测试方法1.3.1鹿血水解剂最佳条件单因素试验采用离心式过滤,将过滤好的8kg鹿血配制成浓度为5%的鹿血溶液。分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶对其进行水解,酶与鹿血浓度比均为2%。调节溶液至每一种酶的最佳条件下(表1)进行试验,同时在反应过程中不断加入1mol/L的NaOH,使pH值保持恒定,并记录其消耗量(mL),用于计算水解度(DH)。待水解结束后,将鹿血水解物置于90℃水浴中5min,使酶灭活,然后用1mol/L的HCl将水解液pH值调整为7.0,真空冷冻干燥水解液,得浅黄色粉末状固体,将冻干样品密封于4℃下保存。通过对水解度、水解物的还原能力和对DPPH自由基的清除率的测定,从而筛选出最佳的蛋白酶。1.3.2碱液的消耗量和浓度参照pH-Stat法［3］,鹿血水解度按下面公式计算:式中:B-水解过程标准碱液消耗量(mL);htot-底物鹿血质中肽键的总数(mmol/g);Nb-标准碱液的浓度(mol/L);1/α-氨基的解离校正系数;MP-水解液底物鹿血质的总量(g)。1.3.3铁氰化钾溶液和三氯乙酸溶液的配制参照Oyaizu等人［4］的方法。取水解液1mL与5mL的磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L,pH6.6)和1%的铁氰化钾溶液混合,并在50℃下水浴20min。水浴完后加入5mL10%的三氯乙酸溶液,3000r/min离心10min。离心后取上清,加入5mL去离子水和1mL0.1%的三氯化铁溶液,在紫外可见分光光度计波长为700nm处测定OD值,OD值越高说明还原能力越大。1.3.4无水乙醇的制备参照Hung等人［5］的方法。取水解后的上清液25μL,加入1×10－4mol/LDPPH·无水乙醇溶液0.7mL混匀,避光反应20min,4000r/min离心10min,取上清夜在紫外可见分光光度计波长为517nm处测吸光度,样品的吸光度为Ai;空白组用等体积的无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液,吸光度为Aj;对照组用等体的蒸馏水代替样品,用等体积的无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液,吸光度为Ao。1.3.5均数sd的计算每个试验重复3次,所有数据均用平均数±SD表示。使用SPSS16.0程序进行数据统计分析,并分析差异显著性(P<0.05)。2结果与分析2.1鹿血水解物的水解由在不同水解时间内鹿血水解物水解度的变化(图1)可以看出,反应开始时鹿血水解度随水解时间的延长变化明显,鹿血水解物水解度变化在5h以后趋于平缓;但是应用碱性蛋白酶水解产生的水解物水解度要高于中性蛋白酶和风味蛋白酶,且差异显著(P<0.05)。2.2不同蛋白酶对鹿血水解物还原能力的影响由在不同水解时间内鹿血水解物还原力的变化(图2)可以看出,鹿血经碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶水解以后的水解物鹿血水解物,随着水解时间的延长还原能力逐渐变强,但是由碱性蛋白酶水解鹿血产生的鹿血水解物的还原能力明显高于中性蛋白酶和风味蛋白酶,且差异显著(P<0.05)。2.3整合小鼠血清dpph自由基的活性由在不同水解时间内鹿血水解物对DPPH自由基清除率的变化(图3)可以看出,鹿血由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶水解以后,鹿血水解物随着水解时间的延长对DPPH自由基的清除作用和对还原能力一样逐渐增强,但是应用碱性蛋白酶水解的鹿血水解物对DPPH自由基的清除作用要明显高于中性蛋白酶和风味蛋白酶,且差异显著(P<0.05)。3单次给药后及其水解