舟山沿海潮间带底泥微生物的分离与鉴定

舟山沿海潮间带底泥微生物的分离与鉴定

海洋微生物是海洋生态系统的重要组成部分，在生物、遗传因素和生态功能方面具有多样性。过去10年间,有近5000种新的海洋天然产物被发现,其中大多数是由海洋微生物产生的。作为海洋生物组成种类最多的一类生物,国外学者认为海洋微生物仍有99.5%～99.9%未被认识,因此有着巨大的开发潜力。作为海洋微生物开发应用的前提,海洋微生物资源多样性的调查就有着不言而喻的重要意义。舟山地处长江、钱塘江、甬江入海口,沿岸流、台湾暖流和黄海冷水团交汇于此,如此独特的海洋环境蕴藏着丰富的微生物资源。本实验对舟山沿海潮间带海泥中的微生物的组成和抗菌活性进行了初步研究,为将来的微生物资源开发和利用提供科学依据。1材料和方法1.1内部大层压结t样品采自舟山沿海7个采样点:长峙岛(CZ)、沈家门渔港(SY)、塘头(TT)、钓山(DS)、鸭蛋山码头(YM)、干榄船厂(GC)、富翅岛(FC)的潮间带海泥(表层以下10～12cm)。采集样品均保存在无菌瓶中,采样结束后当天直接用新鲜海泥样品进行菌种分离实验。1.2蛋白颗粒、酵母膏、牛肉膏的制备放线菌分离培养基包括:(Ⅰ)蛋白胨琼脂培养基、(Ⅱ)高氏一号培养基(GAU)、(Ⅲ)AMM培养基;细菌分离培养基包括:(Ⅳ)Zobell2216E培养基、(Ⅴ)MR2A培养基(Difco)、(Ⅵ)分离培养基(葡萄糖5g,蛋白陈4g,酵母膏5g,牛肉膏4g,琼脂20g,海水1000mL,pH6.0-6.5,115℃灭菌25min);真菌分离培养基包括:(Ⅶ)查氏培养基、(Ⅷ)马丁氏培养基、(Ⅸ)马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)。所有培养基和稀释液用陈海水配置。称取10g海泥,加入盛有90mL灭菌陈海水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,摇床振荡30min(25℃,8400r/min),取上清液逐级稀释为10-1～10-5浓度,每个梯度取100μL上清接种在固体培养基平板上,在25℃恒温培养箱中培养。根据肉眼观察,将所有单菌落分别转接划线在相同培养基平板上,分离纯化。挑出单菌落接种在固体培养基上,置于25℃下继续培养3～7d。1.3中国微生物菌种拮抗实验指示菌包括:①革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Escherichiacoli,简写为EC,下同),荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens,PF),副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP);②革兰氏阳性菌:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,BS),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),藤黄微球菌(Micrococcusluteus,ML);③白假丝酵母(Candidaalbicans,CA);④黑曲霉(Aspergillusniger,AN),所有菌种均来自中国微生物菌种保藏中心。采用纸片扩散法,以测量的抑菌圈(直径Φ)大小来判断拮抗反应的强弱。2结果与分析2.1培养基的分离效果采用9种培养基进行微生物的分离,结果见表1。在用于分离放线菌的3种培养基中,蛋白胨琼脂培养基的分离效果最好;在用于分离真菌的3种培养基中,马铃薯蔗糖琼脂培养基的分离效果最好;分离细菌的培养基中,ZOBELL培养基和MR2A培养基效果较好,而MR2A培养基略胜一筹。对于潮间带底泥微生物的分离,高氏一号培养基和马丁氏培养基的分离效果最不理想。2.2菌株的抗菌活性从7个采样点分离到488株菌株,按照常规细菌学和真菌学鉴定方法,确定82株菌株为放线菌(占总菌株的17.6%),331株菌株为真菌(占总菌株的67.8%),71株菌株为细菌(占总菌株的14.6%),采样点和菌株分布见表2。用8种指示菌进行拮抗实验,结果表明:在所有待测菌株中,有154株菌株具有抗菌活性(占总分离菌株的31.6%),其中抗大肠杆菌的有41株,占26.6%;抗枯草芽孢杆菌的有42株,占27.3%;抗金黄色葡萄球菌的有34株,占22.1%;抗荧光假单胞菌的有9株,占5.8%;抗副溶血性弧菌的有26株,占16.9%;抗藤黄微球菌的有88株,占57.1%;抗黑曲霉的有18株,占11.7%;抗白假丝酵母的有39株,占25.3%。在154株具有抗菌活性的菌株中,对革兰氏阳性菌有拮抗作用的有115株,占74.6%,对革兰氏阴性菌有拮抗作用的有62株,占40.3%,同时对革兰氏阳性和阴性菌都有拮抗作用的菌株有23株,占14.9%。具较广抗菌谱和强抗菌活性的菌株见表3。3带底泥微生物的数量和分布当前对于海洋微生物的研究大多集中在海洋生物共附生微生物的抗肿瘤、抗菌活性物质的提取和分离,极端微生物产酶条件的优化等方面,对潮间带底泥微生物的数量和分布进行系统研究的较少。研究表明,由于潮间带初级生产力程度高,矿物质含量丰富,比外海有更高的沉降率,同时海洋酵母与海洋真菌多喜欢吸附在海泥微颗粒上,因此潮间带底泥中微生物的数量比海水中的数量要明显增多,但由于临港工业发展和围海造田等因素,潮间带的面积在迅速减少,潮间带微生物的多样性受到不同程度的破坏,因此对潮间带微生物的区系调查还是非常必要的。3.1培养基的筛选结果对于微生物的分离,恐怕没有一种培养基可以完全适用于不同微生物。我们针对细菌、真菌和放线菌,各选择了3种常用的分离培养基,通过实验可知,蛋白胨琼脂培养基对于舟山沿海潮间带海泥放线菌的分离效果明显要比高氏一号培养基和AMM培养基好,出菌率高,培养效果显著,同时笔者在实验中发现培养基中加入浓度为50×10-6的重铬酸钾并没有抑制细菌和真菌生长,反而对放线菌的分离有抑制作用,这种现象在其他文献中也有报道,具体机制可能还有待进一步研究。马铃薯蔗糖琼脂培养基对舟山沿海潮间带底泥真菌的分离效果要比查氏培养基和马丁氏培养基显著,马丁氏培养基的分离效果最不理想,出菌率比马铃薯蔗糖琼脂培养基要少两个数量级。ZOBELL培养基和MR2A培养基对舟山沿海潮间带底泥细菌的分离效果都较好,而用海水制备的R2A培养基虽然价格比较贵,但培养基质量好,分离效果更为显著。3.2海泥微生物数量潮间带富含有机物和营养盐,微生物资源非常丰富,潮间带底泥细菌的一般在103～109CFU/g,而98%的链霉菌来自小于3m的海泥中,国内对沿海潮间带的微生物研究较少,纪元等对江苏射阳地县滩涂的微生物数量进行了分析,结果表明表层滩涂土壤(0～30cm)的细菌数量为1.75×107CFU/g,放线菌数量为1.7×106CFU/g;王书锦等对辽宁近海的海泥微生物研究结果显示,海泥平均含细菌总量在(2.2～9.6)×104CFU/g,平均真菌总量在(2.2～8.1)×103CFU/g;本实验结果表明:舟山沿海潮间带的海泥细菌总量在7.6×105～1.8×107CFU/g之间,与江苏沿海地区滩涂的细菌总量基本在同一数量级上,比辽宁海区的数量要多,这可能是东海海区丰富的营养盐沉积导致细菌数量增加;舟山潮间带的海泥放线菌总量在2.4×103～7.3×104CFU/g之间,比江苏射阳的滩涂放线菌数量明显要少。在7个采样点中,鸭蛋山码头和沈家门渔港这两个地点海泥的放线菌数量要比其他区域的数量明显减少,但多样性要强,类似情况在国外也有报道,其原因可能与码头港口来自城市生活污水带来的富营养环境有关;舟山潮间带的海泥真菌总量在3.1×103～5.8×104CFU/g之间,比舟山海域海底沉积物的真菌含量(2250CFU/g)要高,说明潮间带的真菌比海底沉积物的数量要多,同时实验中我们观察到各种真菌的颜色明显,种类众多,说明潮间带海泥中真菌的多样性非常丰富。3.3治疗东南角真菌生长的主要菌种虽然陆地放线菌产生的抗生素占已发现的天然来源抗生素的2/3以上,但本次实验分离到有抑菌活性的