广西红树林土壤放线菌多样性的初步研究

广西红树林土壤放线菌多样性的初步研究

红树林是热带海岸地带独特的植物群落，具有巨大的生物多样性。放线菌不仅能产生多种抗生素,同时也可产生多种具有抗肿瘤活性的物质。而红树林下的土壤底泥对微生物来说是一个特殊的生存环境,此生境中放线菌资源的多样性具有非常重要的研究价值。我国南部边陲潮间带的海岸红树林主要分布于广西、广东、海南、台湾、福建和浙江南部沿岸。其中,广西红树林资源最为丰富,其资源量居全国第2位,广西合浦的山口、东兴的北仑河、防城港的新地和北海的大冠沙等红树林自然保护区内放线菌资源也十分丰富。笔者对广西红树林土壤放线菌的多样性进行了初步研究。采用溶菌酶、蛋白酶K消化破壁、酚-氯仿抽提的方法,有效提取了放线菌基因组DNA,所获得的DNA可直接作为模板用于16SrDNA的扩增鉴定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1红树林的海污泥样本广西合浦山口海泥样本32份、东兴北仑河海泥样本13份、防城港新地海泥样本10份、北海大冠沙海泥样本20份。1.1.2khpo比例的确定培养基组成:可溶性淀粉2.0%、KNO30.1%、K2HPO40.05%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、重铬酸钾0.01%,用过滤海水1000ml配制,调节其pH值为7.2～7.4。1.1.3主要试剂琼脂糖,氯仿,异戊醇,乙醇,λDNAHindⅢ等。1.1.4这些机器恒温水浴锅,离心机,振荡仪,电泳仪,PCR仪等。1.2方法1.2.1放线菌从红树林土壤中分离1.2.1.土壤悬液的测定称取土壤5g,放入45ml盛无菌海水的三角烧瓶中,振荡10min,得稀释10倍的土壤悬液。另取盛有9ml无菌海水的试管4支,取稀释10倍的土壤悬液1ml加入试管中,使之充分混匀,即得10-2土壤稀释液;采用同样的方法依次得到10-3、10-4、10-5土壤稀释液。1.2.1.培养基的制备吸取土壤稀释液各1ml放入培养皿中。将熔化保温50℃左右含有0.01%重铬酸钾的高氏1号培养基分别倒入上述培养皿中,轻轻转动培养皿,使菌液和培养基混匀铺平,凝固后倒置于28～30℃恒温箱中培养6～7d。将形态较典型的放线菌菌落挑出,经过2～3次平板划线分离纯化后转种到高氏1号斜面培养基中保存,编号后置于4℃冰箱中保存备用。1.2.2放线菌重组瘤的dna提取1.2.2.两组菌体生长情况的比较将分离的放线菌转接到高氏1号液体培养基中培养5～7d,取生长良好的放线菌菌液2ml置于EP管中,10000r/min离心8min,弃上清,保留菌体。1.2.2.样品总总提取方法①破壁、蛋白质和核酸分离:每个EP管加入TE溶液300μl,用枪头吹吸3次充分混匀,10000r/min离心5min,弃上清液,再加入20mg/ml的溶菌酶溶液15μl,用枪头充分混匀,37℃水浴4h;每个EP管中加入20mg/ml蛋白酶K溶液8μl,再加入10%SDS溶液和0.5mol/L的EDTA溶液各40μl,轻摇,55℃水浴过夜。②抽提:加等体积的Tris饱和酚,颠倒使之充分混匀,10000r/min离心8min,取上清转至另1支新的1.5mlEP管中,再加等体积24∶1的氯仿/异戊醇,充分混匀,10000r/min离心8min,取上清转至另1支1.5mlEP管中。③沉淀:加等体积异丙醇,-20℃沉淀30min,8000r/min离心5min,弃上清保留沉淀。④洗涤:加70%乙醇洗涤沉淀2次,每次洗涤后8000r/min离心5min,弃上清保留沉淀DNA。⑤洗脱:将EP管倒置于滤纸上,充分干燥后加TE溶液20μl,室温放置15min,4℃过夜使DNA充分溶解。1.2.2.3.辐射诱导组的dna提取效果取5μl基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳(电压80V)进行检测,260nm紫外灯下观察电泳结果。1.2.3引物设计与pcr扩增将得到的放线菌基因组DNA进行16SrDNA扩增(PCR反应采用大连宝生物公司提供的ExTaq试剂盒),取所提DNA各500ng作为模板,10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)5.0μl,dNTPMixture(各2.5mmol/L)4.0μl,设计其16SrDNA特异性引物如下:引物A:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物B:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′,引物(上海生工提供,0.02nmol/L)各1μl,TakaraExTaq(5U/μl)1.0μl,最终补足反应体系至50μl。PCR扩增条件为:94℃预变性5min,95℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸3min,共30个循环,最后72℃延伸10min。取部分PCR扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,其余扩增产物于-20℃条件下保存。2结果与分析2.1放线菌重组瘤的dna提取结果选取6株生物学特性比较典型的菌株提取DNA,所得DNA电泳后在19Kb以上位置出现明显的DNA条带区(图1)。2.21pcr扩增dna以所提基因组DNA为模板进行PCR扩增,可有效扩增出16SrDNA基因(图2)。电泳后目的条带特异性较强、产量较大,说明所提DNA完全可用作PCR反应的模板,而且DNA中不含酶促反应的抑制物。PCR产物纯化后送上海生工进行测序,成功获得了放线菌样本的序列。3海洋生物活性物质是放线菌的重要来源目前,实验室提取细菌DNA的方法主要有以下几类:高温加热法、碱裂解法、SDS裂解法及超声裂解法等,这些方法往往只能提取革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌中的一类,缺乏通用性,步骤繁琐、费时、效率低。该研究建立了一种简便的红树林放线菌基因组DNA的提取方法,得到的基因组DNA具有较好的完整性,无需纯化即可用于16SrDNAPCR扩增等分子生物学操作,为鉴定放线菌奠定了基础。红树林是自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落,海岸潮间带是海洋和陆地的过渡带,具有不同于陆地的性质:水分和盐分高、氧气缺乏,地下微生物与其他生态系统地下微生物具有很大差异。研究表明,红树林根系放线菌的种类和数量,均较菜园、湖畔、海泥等地放线菌丰富。有效获得放线菌基因组DNA是对其进行分类鉴定的前提,可为研究放线菌代谢产物和筛选新的生物活性物质奠定基础。目前,抗药性微生物数量不断增加,急需寻找新的抗生素来源物种。而从陆地放线菌中很难发现和筛选到生物活性物质。据不完全统计,到目前为止,由放线菌产生的抗生素已达4000种以上。从海洋中寻找新的放线菌物种是目前放线菌研究的一个新方向。目前,陆地微生物药物的筛选率逐渐降低,而占地球表面积70%的