热敏灸对抑郁症模型大鼠学习记忆及bdnfmrna表达的影响

热敏灸对抑郁症模型大鼠学习记忆及bdnfmrna表达的影响

抑郁是由焦虑和抑郁引起的疾病，属于精神障碍，伴有思维障碍、运动障碍和认知障碍。该病是精神科领域的常见疾病,随着现代社会竞争压力的进一步加大,抑郁症发病率呈逐年上升趋势,据专家预测到2020年可能成为仅次于心血管疾病的人类第二大疾患。抑郁症给家庭以及社会带来了极大的危害,因而治疗和研究抑郁症成为国内外医学界关注的热点。目前临床上主要是针对抑郁症的某一事实,采取调整体内内分泌激素的水平或提高脑内单胺类递质的含量治疗抑郁症,虽短期症状缓解明显,但其产生的副作用也是一个不容忽视的事实。祖国医学的艾灸疗法治疗抑郁症具有一定的效果。艾灸法,是借助艾草燃烧时发出的温热刺激和药物作用,熏灼特定的穴位,通过经络的传导,起到温通气血、扶正祛邪的作用,从而达到治疗疾病的一种外治法。其操作简便、安全无副作用,越来越受到患者的欢迎。临床上使用艾灸“百会”治疗抑郁症,取得了明显疗效。然而腧穴热敏化艾灸新疗法的出现,则大幅度提高了艾灸临床疗效。多年的临床研究表明,热敏灸治疗多种疾病具有良好的疗效,其防治抑郁症也取得了一定的疗效。在前期的实验研究中,我们已观察到,热敏灸具有改善抑郁症的效果,然而其对抑郁症模型大鼠空间学习记忆的影响及作用机理还不清楚。近年来,脑源性神经营养因子(BDNF)成为神经科学研究的“热点”之一,在抑郁症病理机制中的作用已愈来愈引起人们的重视。因此,本文采用雌性SD大鼠,联合孤养和慢性不可预见性的温和应激(CUMS)制备抑郁症大鼠模型,观察热敏灸“百会”对模型大鼠学习记忆力和海马BDNFmRNA表达的影响,探讨热敏灸治疗抑郁症的效果及作用机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1对大鼠进行cums的刺激和应激SD大鼠27只,雌性,2~3个月龄,由江西中医学院实验动物中心提供,合格证编号:JZDWNo.2011-0074。适应性喂养1周后,采用随机数字表将大鼠分为正常组(6只)、模型组(7只)、艾灸组(7只)和热敏灸组(7只)。正常组(A组):6只/笼,正常饮食进水,不给予任何刺激。模型组(B组):孤养,1只/笼,正常饲养1周后,对其进行21天CUMS。艾灸组(C组):孤养,1只/笼,正常饲养1周后接受21天CUMS。热敏灸组(D组):孤养,1只/笼,正常饲养1周后接受21天CUMS。上述B、C、D组大鼠在21天CUMS后仍每天接受刺激,并且C组于每次应激结束后,艾灸“百会”,每日1次,15min/次,共14天;D组于每次应激结束后,艾灸“百会”,每日1次,40min/次,共14天。1.1.2仪器、检测方法(美国invitrogen公司)、第一链cDNA合成试剂盒(ferments)、PCR试剂盒(ferments);Morris水迷宫(中国医学科学院药物所研制)、Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、3K15冷冻离心机(SIGMA)、UV759S紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、S1000热循环仪(美国Bio-Rad)、电泳仪电源(北京六一仪器厂)、DYCP31BN水平电泳槽(北京六一仪器厂)、GelDocXR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)等。1.2大鼠海马的基于rt-pcr的学习策略1.2.1抑郁症动物模型制备采用CUMS制备抑郁症大鼠模型,根据文献报道进行操作,即对B、C、D组大鼠每周随机给予禁食、禁水、昼夜颠倒、冰水游泳(4℃)、夹尾、电击、水平振激等刺激,每日采取1种方法刺激,连续21天。1.2.2艾灸取穴与方法在大鼠抑郁症模型造成之后,即给予CUMS21天后,将C、D两组大鼠头部的毛发剪去,露出“百会”穴,作为艾灸穴位。艾灸方法:用直径0.4cm,长10cm的艾条(江西中医学院附属医院制),距穴位2cm左右温和灸大鼠,每日1次,C组15min/次,D组40min/次,共14天。1.2.3空间学习记忆测试于艾灸治疗2周后1~5天采用Morris水迷宫进行测试,2次/d。①逃避潜伏期:将测试时间设置为60s,操作者分别从两个入水点将大鼠面向池壁放入水中,观察并实时记录大鼠在60s内找到并爬上平台所需的时间,即逃避潜伏期。大鼠如果在60s内仍未找到平台,则将其牵引至平台停留10s,引导其学习记忆,潜伏期记为60s。逃避潜伏期越短学习记忆越好。②搜索平台策略:在测潜伏期的同时,根据大鼠在水中搜索平台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略。寻找平台的策略分为边缘型、随机型、趋向型和直线型。直线型大鼠以大鼠入水后的第1个点和平台之间的连线为中轴,若大鼠的所在运运轨迹点与中轴的距离均不超过一定范围,该运动策略即为直线型。趋向型与直线型相似,只是运动轨迹与中轴的距离更大。边缘型是以大鼠运动区域的中心为圆心,取一定半径作一个圆,如果大鼠的大部分运动轨迹点在圆外,则认为此运运轨迹为边缘型。如果大鼠的运动轨迹不是上述3种则认为是随机型。1.2.4海马BDNFmRNA的相对表达量采用RT-PCR技术检测。大鼠断头处死后,在冰上迅速剥离出海马。实验步骤:(1)提取组织总RNA。(2)逆转录:取总RNA2μg,随机引物1μL,5×buffer4μL,RNAsin1μL,10mmol/LdNTP混合物2μL,M-MLV反转录酶1μL,补充体积至20μL。反应条件:25℃孵育10min,42℃孵育60min,70℃10min。(3)PCR扩增:PCR扩增体系为25μL,其中含cDNA2μL,上下游引物各1μL,PCR反应液12.5μL,补充体积至25μL。其中BDNF上游引物为5’GCGGCAGATAAAAAGACTGC3’,下游引物5’CCCGAACATACGATTGGGTA3’,产物大小202bp。β-actin上游引物为5’TGACGAGGCCCAGAGCAAGA3’,下游引物5’ATGGGCACAGTGTGGGTGAC3’,产物长度350bp。PCR扩增条件:预变性94℃3min;变性94℃45s,退火55℃1min,延伸72℃45s,30个循环;最后延伸72℃5min。(4)电泳及图像分析:取PCR产物10μL,1.6%琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描扩增产物电泳条带密度,以目的基因条带密度/β-actin条带密度计算产物的相对表达量。1.2.5数据处理采用完全随机设计方法,以(x¯±s)(x¯±s)表示。计量指标满足条件用方差分析进行检验,用统计软件SPSS10.0进行检验,以P<0.05作为显著性差异的标准。2结果2.1热敏性和艾哈巴氏运动对抑郁模型大鼠的学习和记忆的影响2.1.1各组大鼠逃避刑期的比较从表中可以看出,第1天测试,各组大鼠平均逃避潜伏期均比较接近,自第2天至第5天,各组大鼠平均逃避潜伏期迅速下降。此外还可看到,在第2~5天测试中,模型组大鼠的逃避潜伏期均长于正常组大鼠;与模型组相比,艾灸组与热敏灸组大鼠的逃避潜伏期基本上均短于模型组大鼠。结果见表1。2.1.2热敏灸法对抑郁模型大鼠采集平台策略的影响搜索平台的轨迹大鼠在进行定位航行搜索平台试验时具有不同的搜索策略。直线型大鼠知道水下平台的方位,从入水点直接向平台方位寻找,其记忆力最强。趋向型大鼠可能知道水下平台的方位,在一次找不到后会试图再次尝试到目的地寻找。随机型大鼠在搜索目标时,漫无目的地撞大运,靠运气找到水下平台。边缘型大鼠沿水池周边企图找到水下平台,没有学会找平台的要领。见图1。上面四个轨迹图是大鼠在水中搜索平台的游泳轨迹。图中大圆代表水池,小圆代表水下平台,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表第一、二、三、四象限,圈中线路代表大鼠游泳轨迹。大鼠的搜索策略从表中可以看出,以直线型为搜索策略的多为正常组大鼠;以趋向型为搜索策略的多为艾灸组和热敏灸组大鼠;而模型组大鼠的搜索策略多为随机型和边缘型。结果见表2。2.2海马的brnfmrna表达BDNF和β-actin分别出现在约200bp及300~400bp处,与引物设计预想得到的片段相同(图2)。从表中可以看出,与正常组大鼠相比,模型组大鼠海马的BDNFmRNA相对表达量较低;与模型组相比,艾灸组和热敏灸组大鼠海马的BDNFmRNA相对表达量增加,差异有统计学意义,见表3。3心理疏导治疗抑郁症热敏灸,通俗地说就是在热敏化腧穴上进行艾灸。临床观察表明,人体腧穴存在敏化态与静息态两种功能态,当人体发生疾病时能使体表腧穴发生敏化,敏化的类型多种多样,而腧穴热敏化是经穴敏化的一种新类型,处在敏化态的腧穴对外界相关刺激呈现腧穴特异性的“小刺激大反应”,因此热敏灸的疗效较传统悬灸疗法有大幅度提高。其次,与传统的悬灸相比,热敏灸的灸量不同。灸量即艾灸的每次有效作用剂量。艾灸剂量由艾灸强度、艾灸面积、艾灸时间三个因素组成,在前两个因素基本不变的情况下,艾灸剂量主要由艾灸时间所决定。在施行热敏灸疗法时,每穴的施灸时间不是固定不变的,而是因人因病因穴而不同,是以个体化的热敏灸感消失为度的施灸时间,一般需40min,而传统悬灸的灸量每次每穴一般从10~15min,或者以局部皮肤潮红为度。为此,我们同时观察并比较传统艾灸和热敏灸大鼠“百会”对抑郁症的治疗效果。中医学认为,脑为元神之府,抑郁症的病位在脑,可通过治理督脉为主来调节脑神,从而治疗抑郁症。《难经·二十八难》曰:“督脉者,起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入络于脑。”督脉为阳脉之海,总督一身之阳气,统领诸经,进而联系五脏六腑,对各经脉脏腑病变均有调节作用。百会为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会,位居于巅顶,犹天之极星居此,为百脉聚汇之处,可调补中气,健脑宁神,是宁心调神之要穴。在前期研究中,我们已观察到:艾灸“百会”15min和艾灸“百会”40min(热敏灸)均能增加大鼠Open-Field测试中的水平活动和直立活动得分,提高糖水消耗百分比,显示艾灸和热敏灸具有增加大鼠活动度,提高大鼠对周围环境的兴趣的作用,表明艾灸和热敏灸具有改善抑郁症的效果。然而,关于艾灸和热敏灸对大鼠空间学习记忆是否有改善作用及作用机制还不清楚。据文献记载,抑郁症除情绪低落外,通常还伴有思维迟缓、意志活动减退等症状,即存在认知功能障碍,该病伴发的认知障碍主要是注意力和学习记忆力的下降。本实验结果显示:给予CUMS后,模型组大鼠水迷宫测试平均逃避潜伏期长于正常组大鼠,其搜索平台的策略以边缘型和随机型为主,而艾灸组和热敏灸组大鼠水迷宫测试平均逃避潜伏期短于模型组大鼠,其搜索平台的策略以趋向型为主。表明抑郁症模型大鼠学习记忆力发生了改变,而艾灸和热敏灸均具有提高抑郁症模型大鼠的学习记忆力。然而它们的作用机制尚不完全清楚。脑源性神经营养因子(BDNF)属于神经营养素家族,广泛分布于中枢神经系统中,尤其是大脑皮层和海马区,对神经系统的发生、发育过程起着重要作用,可促进神经细胞的存活、增殖、生长、分化及功能表达,而且对损伤的神经元有保护、预防退变和促进再生的作用,是神经科学研究的“热点”之一。近年来BDNF在抑郁症病理机制中的作用愈来愈引起人们的重视。众所周知,海马与情绪及认知关系十分密切。有研究表明,抑郁症模型大鼠海马BDNF表达减少,经抗抑郁治疗后,海马BDNF表达明显升高