青霉piniciliumspwf-106的抗肿瘤活性次级代谢产物研究

青霉piniciliumspwf-106的抗肿瘤活性次级代谢产物研究

海洋微生物是海洋生态系统的重要组成部分。许多研究表明，海洋微生物能够产生丰富的结构新的、具有显著生理活性的次代谢产物。目前，海洋微生物已成为广阔的开发前景的药物资源，受到国内外科学家的关注。我们采用人肝癌HepG2细胞系,利用MTT法结合细胞形态镜检,从海洋环境中寻找抗肿瘤活性菌株,并进行大规模发酵,通过活性跟踪分离纯化其抗肿瘤活性次级代谢物。本文对来源于烟台黄海近海海泥的真菌Penicilliumsp.WF-06的抗肿瘤活性次级代谢产物进行了研究,从其发酵产物中分离并鉴定了6个单体化合物,分别为GliocladineC(1)、环-甘氨酰脯氨酸(2)、环-苯丙氨酰脯氨酸(3)、环-色氨酰丙氨酸(4)、1,3-二氨基-2-硝基苯(5)和3-羧基吲哚(6),并初步评价了它们对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制活性,本文报道这6个化合物的分离纯化、结构鉴定及其抗肿瘤活性。1材料和方法1.1仪器、试药与分析分析用高效液相色谱仪用Waters公司产品(Waters600泵,Waters996二极管阵列检测器,Millennium32工作站,CapcellPakC18柱:5µm,4.6mm×250mm)。制备用高效液相色谱仪用日本岛津公司产品(LC-6AD泵,SPD-M20AVP检测器,SCL-10AV型系统控制器,CapcellParkC18柱:5µm,20mm×250mm)。质谱用MarinerAPI-TOF型质谱仪。核磁共振谱用JEOLJNM-ECP400型(1HNMR600MHz,13CNMR100MHz)。旋转蒸发仪用日本东京理化公司EYELAN-N型。真空浓缩仪用Savant公司SC250DDA型。摇床用上海智城分析仪器制造有限公司ZHWY2102型。分析天平用上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂JA1003N型。柱层析及薄层层析用硅胶H(10～40µm):烟台化工集团公司;Sephadex™LH-20:Pharmacia公司;LiChroprep®RP-18(25～40µm):Merck公司;顺铂(CDDP):Sigma公司;石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、浓硫酸、乙酸、DMSO等均为分析纯;液相用水为Milli-Q超纯水,甲醇、乙腈为色谱纯。1.2菌株的分离和培养1.2.1坏死性细胞毒活性真菌Penicilliumsp.WF-06采自烟台黄海沿海海泥,初筛结果显示坏死性细胞毒活性。菌种特征:菌落表面呈墨绿色,背面颜色稍深,孢子呈浅绿色,孢子生长速度快。菌株固体斜面样品现保存于北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室。1.2.2发酵液和液体萃取乙酸乙酯浸膏的制备取该菌株适量,接种到琼脂固体斜面培养基上,28ºC培养箱中培养3d,用接种环取适量孢子和菌体接种到3个500mL锥形瓶中,内含150mL真菌培养液(蛋白胨1%、味精1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%),置于摇床中,在28ºC、130r/min条件下培养3d,从而获得种子培养液。取种子液适量,按5%的接种量到100个500mL锥形瓶中(内含150mL上述培养液),置于摇床中,在与种子相同的发酵条件下分别发酵7d,获得15L发酵液,用纱布过滤得到发酵液和菌丝体两部分。发酵液减压浓缩至5L,加入等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,经减压浓缩得到发酵液的乙酸乙酯浸膏(4.9g);菌丝体在80%丙酮-水中超声破碎后取水层,同样加入等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,经减压浓缩得到菌丝体的乙酸乙酯浸膏(8.6g);合并两者共得到乙酸乙酯粗浸膏(13.5g)。1.3恶意程序活性乙酸乙酯粗浸膏(13.5g)经50g硅胶G拌样,干法上300g硅胶H填装的减压柱,石油醚-氯仿-甲醇溶液梯度洗脱,洗脱组分经TLC薄层检测后合并成7个组分(Fr.1～7),对各组分进行抗肿瘤活性检测,结果显示Fr.3(108mg)、Fr.4(245mg)、Fr.6(228mg)具有坏死性细胞毒活性。采用反复正相、反相硅胶柱层析、SephadexLH-20、PTLC及半制备HPLC等分离技术对活性组分进行分离纯化。Fr.3在CHCl3-MeOH溶剂系统中重结晶及石油醚-CHCl3梯度洗脱,再经SephadexLH-20在CHCl3-MeOH(1:1体系中)柱层析,得到化合物3(4.0mg);Fr.4先后用CHCl3-MeOH硅胶柱梯度洗脱、再经反复CHCl3-MeOH溶液SephadexLH-20柱层析、HPLC半制备(20%～80%甲醇-水梯度洗脱),得到化合物1(6.6mg)、5(3.0mg)和6(7.2mg);Fr.6经石油醚-丙酮系统梯度洗脱及CHCl3-MeOH溶液(1:1～2:3)SephadexLH-20柱层析,得到化合物2(3.6mg)和4(4.1mg)。1.4肿瘤细胞酶活性检测抗肿瘤活性筛选采用人肝癌HepG2细胞系,细胞培养液用含有10%FBS的RPMI-1640培养基,内含有100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素,在37ºC、通入5%CO2的细胞培养箱中传代培养。抗肿瘤活性测试采用MTT方法:取对数生长期的肿瘤细胞,将细胞密度调至每毫升含有2×105个细胞,按每孔200μL接种于96孔细胞培养板中,于37℃通入5%CO2的培养箱中培养4h。样品分别设定5个浓度梯度,每个浓度设3个平行样,同时设阳性、阴性对照,每孔加样品液或空白液各2μL,培养24h,然后每孔加MTT溶液10μL,继续培养4h,37℃、2000r/min离心8min,吸去上清。每孔加入DMSO各100μL,在微量振荡器上振荡15min,至结晶完全溶解后,酶标仪测定每孔570nm处的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值按IR%=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100%式计算样品对细胞增殖的抑制率(IR%),并采用bliss法计算出半数抑制率IC50和标准方差。2结果2.1cnmr-meod的鉴定化合物1,白色结晶(MeOH),碘化铋钾显色反应呈阳性,提示该化合物可能是生物碱类。阳离子ESIMS在m/z465.2处给出准分子离子峰[M+H]+峰,提示分子量为464,结合NMR谱推测分子式为C23H20N4O3S2。1HNMR(600MHz,Acetoned6)δ:10.10(1H,s,H-1′)、8.23(1H,d,J=8.0Hz,H-4′)、7.56(1H,d,J=7.0Hz,H-10)、7.45(1H,s,H-2′)、7.40(1H,d,J=7.7Hz,H-7′)、7.07(1H,m,H-6′)、7.03(1H,m,H-5′)、6.90(1H,t,J=7.0Hz,H-8)、6.68(1H,brd,J=9.5Hz,H-7)、6.65(1H,s,H-11)、6.60(1H,m,H-9)、6.01(1H,s,H-5a)、2.66(3H,s,H-12)、1.69(3H,s,H-13)。13CNMR(150MHz,Acetone-d6)δ:167.3(C-1)、163.0(C-4)、148.6(C-6a)、138.0(C-1′a)、132.9(C-10a)、128.8(C-8)、127.3(C-3′a)、124.6(C-10)、123.8(C-2′)、122.3(C-4′)、122.0(C-6′)、119.6(C-5′)、119.5(C-9)、115.5(C-3′)、112.2(C-7′)、110.9(C-7)、83.2(C-5a)、81.0(C-11)、78.5(C-11a)、74.4(C-3)、62.1(C-10b)、27.5(C-12)、17.6(C-13)。13CNMR和DEPT谱中给出两个酰胺羰基信号δ167.3(C-1)和163.0(C-4),在δ77.7(C-11a)和74.4(C-3)给出两个季碳信号,提示分子中可能含有二氧哌嗪骨架结构,结合1H1HCOSY谱可确定分子中含有两个吲哚环,如图2所示。在1HNMR低场区δ6.01(H-5a)和6.65(H-11)处给出两个连氧或氮的次甲基质子信号,δ2.66处给出氮甲基信号,结合HMQC和HMBC谱,推出各片断的耦合关系,见图1,与文献对照,确定该化合物为GliocladineC,见图2。化合物2,无定型粉末,[α]D20-14.8(c1.0,MeOH)。该化合物经6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反应呈阳性,提示化合物2是肽类或环肽类化合物。阳离子ESIMS在m/z155处给出准分子离子峰[M+H]+峰,提示分子量为154,分子中可能含有偶数氮,结合NMR谱推测分子式为C7H10N2O2。IR(KBr)γmax3424、3190、3051、2959、2888、1678、1469cm-1,提示分子中可能含有活泼氨基和酰胺基。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:4.23(1H,m,H-3)、4.10(1H,d,J=16.8Hz,H-6a)、3.71(1H,d,J=16.8Hz,H-6b)、3.53(2H,m,H-7)、2.31(2H,m,H-9)、1.99(2H,m,H-8)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:172.0(C-4)、166.5(C-1)、59.9(C-3)、46.9(C-6)、46.3(C-7)、29.3(C-9)、23.3(C-8)。13CNMR和DEPT谱给出两个酰胺羰基信号(δ172.0,C-4;166.5,C-1),1HNMR中δ4.23(1H,m)显示分子中含有1个连氮的次甲基,δ4.10(1H,d,J=16.8Hz)和δ3.71(1H,d,J=16.8Hz)为同碳上的氢,并与羰基、氨基相连,提示该化合物可能是环二肽类化合物,并含有甘氨酸残基,与文献对照,确定该化合物为环-甘氨酰脯氨酸[cyclo-(Gly-Pro)],见图2。化合物3,白色无定型粉末,该化合物经6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反应呈阳性,提示化合物3也是肽类或环肽类化合物。阳离子ESIMS显示其分子量为244,分子中可能含有偶数氮,结合NMR确定分子式为C9H16N2O2。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:7.29(2H,dd,J=7.7,1.0Hz,H-2′,H-6′)、7.26(2H,brt,J=7.7Hz,H-3′,H-5′)、7.20(1H,brt,J=7.7Hz,H-4′)、4.43(1H,t,J=4.2Hz,H-2)、4.05(1H,dd,J=6.6Hz,H-5)、3.53(1H,m,H-2aa)、3.30(1H,m,H-2ab)、3.15(2H,m,H-7)、2.08(1H,m,H-9a)、1.79(2H,m,H-8)、1.22(1H,m,H-9b)。1HNMR谱给出15个氢,低场区δ7.29-7.20有5个芳香氢,提示有一单取代苯环;δ4.43(1H,brs)和δ4.06(1H,m)可能是连氮的2个次甲基氢,提示该化合物为环二肽。δ3.53(1H,m)和δ3.30(1H,m)是苄基两质子信号,δ3.15(2H,m)、δ2.08(1H,m)、δ1.79(2H,m)和1.22(1H,m)可能是吡咯环亚甲基氢信号,且分子中无甲基峰,与文献对照,分析该化合物为环-苯丙氨酰脯氨酸[cyclo-(Phe-Pro)]。化合物4,白色结晶(MeOH),该化合物经6mol/LHCl于110℃下水解1h后,茚三酮反应呈阳性,提示化合物3也是环肽类化合物。阴离子ESIMS在m/z256.3处给出分子离子峰[M-H]-峰,提示分子量为257,分子中可能含有奇数氮,结合NMR谱推测分子式为C14H15N3O2。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ:10.89(1H,brs,NH-1′)、8.02(1H,brs,NH-2)、7.90(1H,brs,NH-5)、7.56(1H,d,J=8.0Hz,H-5′)、7.30(1H,d,J=8.0Hz,H-8′)、7.04(1H,s,H-2′)、7.02(1H,dt,J=0.8,7.3,8.0Hz,H-6′)、6.93(1H,dt,J=0.8,7.3,8.0Hz,H-7′)、4.11(1H,dd,J=4.0,4.6Hz,H-3)、3.58(1H,q,J=7.0Hz,H-6)、3.24(1H,dd,J=4.6,14.3Hz,H-3aa)、3.01(1H,dd,J=4.6,14.3Hz,H-3ab)、0.42(3H,d,J=7.0Hz,H-6a)。13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ:167.7(C-1)、166.7(C-4)、135.8(C-9′)、127.8(C-4′)、124.5(C-2′)、120.8(C-6′)、118.9(C-5′)、118.4(C-7′)、111.1(C-8′)、108.5(C-3′)、55.4(C-3)、49.8(C-6)、28.8(C-3a)、19.5(C-6a)。综合以上信息并与文献对照,确定该化合物为环-色氨酰丙氨酸[cyclo-(TrpAla)],见图2。化合物5,淡红色无定形粉末,阴离子ESIMS在m/z152.1处给出准分子离子峰[M-H]-峰,提示分子量为151,结合NMR谱推测分子式为C6H7N3O2。IR(KBr)γmax3444、3300、1334、1617、1542cm-1,提示分子中可能含有氨基、硝基和苯环。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:7.34(1H,dd,J=1.4,8.9Hz,H-6)、6.79(1H,dd,J=1.4,7.7Hz,H-4)、6.44(1H,dd,J=7.7,8.9Hz,H-5)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:146.2(C-1)、142.1(C-3)、112.0(C-2)、123.2(C-6)、117.9(C-4)、116.1(C-5)。结合DEPT谱并参考文献,确定该化合物为1,3-二氨基-2-硝基苯(1,3-diamino-2-nirtobenzene),见图2。化合物6,白色片状晶体(MeOH),阴离子ESIMS在m/z160.2给出准分子离子峰[M-H]-峰,提示分子量为161,结合NMR谱推测分子式为C9H7NO2。1HNMR(600MHz,MeOD)δ:8.04(1H,d,J=8.7Hz,H-9)、7.94(1H,d,J=5.1Hz,H-2)、7.42(1H,d,J=7.0Hz,H-6)、7.19(1H,m,H-7)、7.16(1H,m,H-8)。13CNMR(150MHz,MeOD)δ:169.1(C-10)、138.2(C-5)、133.4(C-2)、127.5(C-4)、123.6(C-7)、122.4(C-8)、122.0(C-9)、112.9(C-6)、108.7(C-3)。结合DEPT谱并与文献对照,鉴定该化合物为3-羧基吲哚(1H-indole-3-carboxylicacid),见图2。2.2mtt法检测细胞增殖抑制活性以人肝癌HepG2细胞为抗肿瘤活性筛选靶细胞,采用细胞形态镜检和MTT法在细胞水平上初步评价化合物1、2、3、4、5和6的抗肿瘤活性。HepG2细胞经浓度为10.0μmol/L化合物