花生壳膳食纤维低密度脂蛋白吸附剂的制备及性能研究

花生壳膳食纤维低密度脂蛋白吸附剂的制备及性能研究

1采用现用的治疗方法随着社会的发展，人们生活水平不断提高，发病率高、脂肪性、肺动脉硬化的发病率也在增加，这严重危害了人类健康。临床医学表明，低密度脂肪酸（ldl）对胆固醇的运输起着重要作用，这与胆固醇代谢和动脉硬化之间的关系最大。目前使用药物疗法和饮食疗法对该病的治疗效果均不十分满意,而采用血液灌流方法,通过吸附剂选择性地去除血液中的低密度脂蛋白胆固醇来治疗高脂血症,是一种行之有效的、有很好前景的方法。传统LDL吸附剂所选用的载体多种多样,所采用的配基也较多。膳食纤维由于价廉、良好的反应性及可再生性,被广泛用于吸附剂载体材料。膳食纤维分子链上大量的羟基,使膳食纤维具有优良的亲水性和化学反应性。膳食纤维通过羟基的功能基化反应,可以键连各种配基。且膳食纤维生物相容性良好,因此以膳食纤维为载体制成不同种膳食纤维衍生物,可进行血液中的胆固醇吸附。本实验制备出一种新型双亲型低密度脂蛋白吸附剂,该吸附剂同时利用疏水作用和静电作用对血浆中的胆固醇脂蛋白进行吸附,可有效降低血浆中胆固醇含量,是一种新型的高效低密度脂蛋白吸附剂。2猪血浆中co和ldl-c含量的检测2.1合成基本原理(见下页化学反应式)2.2试剂与仪器(1)主要试剂:花生壳膳食纤维,由本实验室自制;环氧氯丙烷(分析纯),上海凌峰化学试剂有限公司;十二胺(分析纯),飞翔化工有限公司;氯磺酸(分析纯),上海亭新化工厂。化学反应式(2)主要仪器:721分光光度计,上海第三分析仪器厂;HH-2A恒温水浴锅,金坛市宏华仪器厂。2.3实验方法2.3.1花生壳膳食纤维的活化将20g花生壳膳食纤维放入三口烧瓶中,加入100ml的环氧氯丙烷和3mol/L的NaOH溶液400ml,40℃水浴下反应2.5h。将产品用无水乙醇和去离子水反复洗涤至中性,抽滤得活化产品。2.3.2活化膳食纤维的胺化20g已活化膳食纤维(湿态)放入三口烧瓶中,加入30ml去离子水,然后加入20ml十二胺。将三口烧瓶放入70℃的恒温水浴锅中,在搅拌条件下,胺化反应4h。反应结束后,冷却、抽滤,并用乙醇和去离子水充分洗涤至中性。即得胺化膳食纤维产品。2.3.3磺化试剂的制备以甲酰胺为反应介质,制备氯磺酸-甲酰胺磺化试剂。将100ml甲酰胺放入三口烧瓶中,置于冰盐浴下。在搅拌条件下,滴加30ml的氯磺酸。控制氯磺酸的滴加速度,使反应体系的温度保持在5℃以下。滴加完毕后,得到白色黏稠液体,供磺化使用。2.3.4胺化膳食纤维的磺化将上述含磺化试剂的三口烧瓶放入60℃的恒温水浴锅中,加入10g胺化后的膳食纤维,在搅拌条件下进行磺化反应,反应时间为3h。反应结束后,向反应体系中加入适量去离子水,使充分溶解。将所得产品抽滤,充分洗涤至中性,即得最终产品。2.4吸附实验取少量新鲜猪血于离心试管中,3000r/min离心10min,抽取血浆,备用。吸附剂先用0.9%的生理盐水充分浸泡24h溶胀后,用滤纸吸干其表面水分,溶胀度为16.5%。溶胀度=(Mw-Md)/Md式中:Mw为溶胀后湿态的质量;Md为溶胀前干态的质量。采用静态吸附法。称取一定量的吸附剂于三角烧瓶中,加入5ml猪血浆,于37℃下恒温振荡2.5h,离心分离,取上清液进行测定。用生化实验方法测定吸附前后猪血浆中的TC、HDL-C和LDL-C的含量,LDL-C=TC-(HDL-C)。吸附率(A)由下式计算:A%=C0−C1C0×100%A%=C0-C1C0×100%式中:A为吸附率;C为血浆中TC,HDL-C、LDL-C的浓度;Co为吸附前浓度;C1为吸附后浓度。3结果与讨论3.1反应条件的确定3.1.1反应时间及温度当固定反应温度为40℃,反应时间为2h时,测定产品环氧值含量。NaOH浓度对环氧值含量的影响,如图1(a)所示;当NaOH浓度大于3mol/L,环氧值含量随NaOH浓度的升高而降低。因此,NaOH浓度可选为3mol/L。当固定反应时间为2h,NaOH浓度为3mol/L时,当反应温度达到40℃,环氧值含量基本稳定(见图1(b))。当固定反应温度为40℃,NaOH浓度为3mol/L,反应时间大于2.5h时,环氧值含量随时间的增大而减小(见图1c))。因此,反应时间确定为2.5h。3.1.2二胺用量对各合成纤维平均总胆固醇的吸附率的影响当固定反应温度为60℃,反应时间为4h,膳食纤维用量与十二胺用量比值(g/ml)为1∶1时,对3个血浆样本的平均总胆固醇吸附率达到最大,如表1所示。当固定十二胺用量,反应时间为4h,反应温度达到70℃时,对3个血浆样本的平均总胆固醇吸附率达到最高,如图2(a)所示。当固定十二胺用量,反应温度为70℃,反应时间为4h时,对3个血浆样本的平均总胆固醇吸附率达到最大,如图2(b)所示。因此,在温度为70℃,反应时间为4h,膳食纤维和十二胺用量(g/ml)比值为1∶1时,所得胺化膳食纤维的红外光谱图显示(见图3a),在波数3450cm-1处有强吸收峰,表明有-OH基团的O-H键和-NH-基团的N-H键伸缩振动;在2960cm-1处有中强吸收,表明有-CH2或-CH3基团的C-H伸缩振动;在2880cm-1处有中强吸收,表明有-CH2基团的C-H键伸缩振动;在1662cm-1处有强吸收,表明有-NHCOCH基团的C=O键的伸缩振动、非对称伸缩振动和N-H键的弯曲振动;在1071cm-1处有强吸收,表明有C-O的伸缩振动和C-N的伸缩振动。3.1.3亲水性膳食纤维的磺化反应固定甲酰胺(10ml)及胺化膳食纤维(1g)用量,选取氯磺酸的用量(Vch)、反应温度(Reactiontemperature)、反应时间(Reactiontime)三个因素,做正交实验,测定产物对3个血浆样本的平均总胆固醇吸附率,结果如表2所示。由表2可知,各影响因素中,氯磺酸用量影响最大,反应温度次之,反应时间的影响因素最小。1g胺化膳食纤维的磺化,固定甲酰胺用量10ml,最佳磺化条件是A1B1C1,即氯磺酸用量3ml,反应温度60℃,反应时间3h,得到双亲型膳食纤维吸附剂。其红外光谱图如图3(b)所示。由双亲型膳食纤维吸附剂的红外光谱可以看出,在波数3460cm-1处有强吸收峰,显示有-OH基团的O-H键和-NH-基团的N-H键伸缩振动;在2940cm-1处有中强吸收,显示有-CH2或-CH3基团的C-H伸缩振动;在1730cm-1处有强吸收,显示有-NHCOCH基团的C=O键的伸缩振动、非对称伸缩振动和N-H键的弯曲振动;在1170cm-1处有中强吸收,表明有SO32-基团的S=O键伸缩振动;在1060cm-1处有强吸收,显示有C-O的伸缩振动和C-N的伸缩振动。在831cm-1指纹区有吸收,表明有C-O-S键的伸缩振动。3.2血浆tc、hdl-c含量分别称取0.05、0.1、0.15、0.2、0.3g吸附剂于三角烧瓶中,加入5ml的血浆,于38.5℃下恒温振荡2.5h,离心分离,取上清液测定吸附前后血浆中的TC、HDL-C的含量。对5个血浆样本进行吸附实验,吸附结果如表3所示。由表3可知,当双亲型吸附剂用量0.15g,血浆用量5ml时,其对TC和LDL-C的平均吸附率分别可达到49.9%和61.5%,而对HDL-C的吸附率为25.2%,表现出良好的选择性。3.3低密度脂质体吸附剂吸附机制称取0.15g吸附剂于三角烧瓶中,加入5ml血浆,于38.5℃下恒温振荡2.5h,离心分离,取上清液测定吸附前后血浆中的TC、HDL-C的含量。对17个血浆样本进行吸附实验,吸附结果如表4所示。目前,以纤维素为载体的低密度脂蛋白吸附剂,主要以胆固醇、氨基酸和磺酸基团为配基,对低密度脂蛋白的吸附率达到56%。由表4可知,本实验研制的双亲型吸附剂对TC平均吸附率为40.8%,LDL-C平均吸附率为50.8%,HDL-C的平均吸附率为23.6%;具有良好的选择性。由于双亲型膳食纤维吸附剂同时具有亲水基团和疏水基团,利用十二胺的碳链疏水作用和磺酸基团的静电作用,可对血浆中的胆固醇脂蛋白进行吸附,对TC与LDL-C均有很高的吸附率,可显著降低血浆TC和LDL-C水平。因为LDL与HDL表面碱性氨基酸残基的差异,二者带电量也有明显不同。同HDL相比,LDL表面带有大量正电荷基团。根