天然发酵草酸汁中分离出的乳酸菌的分离、筛选及抑菌活性研究

天然发酵草酸汁中分离出的乳酸菌的分离、筛选及抑菌活性研究

作为中国东北的传统食品，它有着悠久的历史、丰富的营养、柔和的口感和深受消费者喜爱的味道。研究表明,天然发酵酸菜中含有大量的乳酸菌,大多对健康有益。细菌素(bacteriocin)是由细菌产生的一种抗生代谢产物,含对同源种或近似种有拮抗作用的蛋白质或多肽物质。本研究从不同的酸菜汁中筛选出2株乳酸菌,它们产生的细菌素可以抑制单核细胞增生李斯特菌,排除酸的干扰后,仍然具有抑菌活性,经常规生理生化鉴定,确定这2株菌分别为短乳杆菌和植物乳杆菌。本研究结果为工业生产细菌素提供了理论与试验支持。1材料和方法1.1试验材料1.1.1材料表面供试材料为16种天然发酵酸菜汁。指示菌为单核细胞增生李斯特菌,由沈阳农业大学食品学院畜产品加工实验室保存。1.1.2培养基的制备电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);超净工作台(苏州医用仪器厂);HZS-H型电热恒温水浴锅(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);ZMB-300E型显微镜(上海宙山精密光学仪器有限公司);低速离心机(北京医用离心机厂);电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);牛津杯(10mm×7.8mm×6mm)(河南新乡美乐食品机械厂);游标卡尺(哈尔滨量具刀具厂);酸度计(上海精密科学仪器有限公司);电热手提式高压灭菌锅(上海医用核子仪器厂)。1.1.3培养基MRS(MRS+CaCO3)培养基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母提取物5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,Tween-801mL,MgSO4·7H2O0.58g,MnSO4·4H2O0.25g,CaCO32%,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH值6.2~6.4,121℃高压蒸汽灭菌15min。改良MRS琼脂培养基:在MRS琼脂培养基的基础上再加入0.5%碳酸钙。TSB培养基:胰蛋白胨17g,多价胨3g,酵母膏6g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,蒸馏水1000mL,pH值7.2~7.4。LB培养基:牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠5g,蒸馏水1000mL,pH值6.5。1.2测试方法1.2.1革兰氏染色鉴定酸菜汁※梯度稀释※37℃培养48h※单菌落革兰氏染色※镜检※选取溶钙圈较大的菌落※划线分离纯化2~3次※选取纯菌种※4℃保存※生理生化鉴定。1.2.2培养基的制备用无菌水将酸菜汁稀释成6个浓度梯度,各取10-4、10-5和10-63个浓度梯度的菌液于改良MRS琼脂培养基中,37℃恒温培养48h。选取具有明显溶钙圈的菌落,进行革兰氏染色及镜检,挑选革兰氏阳性菌进行划线分离纯化2~3次,将分离纯化后的单菌落再一次进行镜检,转移到MRS斜面培养基上,并于4℃保存,待鉴定。1.2.3产细菌素菌素的初步筛选将保存的乳酸菌用接种环接种在MRS液体培养基中,37℃静置培养48h后,利用点种法对单核细胞增生李斯特菌做抑菌试验,并选取抑。1.2.4抑菌活性试验将初筛后具有抑菌效果的菌株培养于MRS液体培养基中,24h后将菌液倒入5mL离心管中,4000r/min离心10min,测上清液的pH值。将各指示菌配成浓度为107CFU/mL的菌悬液,利用牛津杯琼脂扩散法对指示菌进行抑菌试验,即在LB固体和MRS半固体双层培养基平板上均匀地放入牛津杯,并用微量移液器取150μL被检菌离心上清液注入牛津杯中。把上述平板放在37℃的培养箱中培养24h后,用游标卡尺测定抑菌圈的大小。1.2.5识别菌株的性质1.2.5.酸发酵对指示菌抑菌效果的影响用1mol/LNaOH溶液将培养24h后的待测发酵液的pH值调节到5.0后,用牛津杯琼脂扩散法对指示菌进行抑菌试验,用同样pH值的乳酸作对照。1.2.5.过氧化氢对革兰氏阴性菌生长的影响过氧化氢是乳酸菌在抑菌过程中产生的强氧化剂,可以抑制乳酸菌尤其是革兰氏阴性菌的生长,因此必须排除过氧化氢的干扰。将浓度为5mg/mL的过氧化氢酶加入到待测离心发酵液中,37℃处理2h,以未处理的发酵液为对照,检测所筛乳酸菌对指示菌的抑制效果。1.2.5.培养基细胞培养在待测发酵上清液中分别加入浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶,37℃灭酶2h,取出后用牛津杯琼脂扩散法做抑菌试验。1.2.6产细菌素菌的鉴定依照《乳酸菌分类鉴定及试验方法》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版进行产细菌素乳酸菌菌种鉴定。2结果与分析2.1菌株抑菌活性测定从16种酸菜汁中分离出38个具有溶钙圈且形态不同的乳酸菌菌株,采用牛津杯琼脂扩散法对单核细胞增生李斯特菌进行抑菌试验,得到18株具有抑菌活性的乳酸菌菌株,以备进行复筛。从图1可以看出,L5、L7、L8、L9、L11、L15和L18等7个菌株的抑菌活性比较显著,抑菌圈直径均在10mm以上。2.2关于蘑菇的性质的测定2.2.1菌种的抑菌试验乳酸菌对指示菌的抑制作用可能是某些有机酸作用的结果,为了排除酸的干扰,将具有抑菌效果的菌株采用牛津杯琼脂扩散法,对指示菌进行抑菌试验,以pH值5.0的乳酸作对照。试验结果如表1所示,pH值5.0的乳酸抑菌作用比较小,而pH值5.0的菌株发酵液具有较强的抑菌活性,说明在排除有机酸的干扰后,这些乳酸菌发酵液中还存在其他的抑菌活性物质。2.2.2抑菌活性测定结果将上述10株经过过氧化氢酶处理的乳酸菌株进行抑菌试验,结果见表2。从表2看出,6株菌虽然抑菌活性有所降低,但仍对指示菌有抑制作用,而其他4株菌抑菌活性完全丧失。由此可知,在发酵液中除了过氧化氢的抑菌作用外,还有其他抑菌物质存在。2.2.3抑菌试验结果分别将浓度为0.5mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶加入到上述6株菌的离心发酵上清液中,对指示菌进行抑菌试验,结果见表3和图2。试验结果表明,菌株L9和L11仍保持良好的抑菌效果,说明起抑菌作用的物质是类似蛋白质物质的细菌素。2.3产细菌素菌的鉴定2.3.1革兰氏染色及菌体形态鉴定分别将纯化的菌株L9和L11接种到MRS固体培养基上,37℃培养48h,观察菌落特征,并挑取单菌落进行革兰氏染色,于显微镜下观察菌体形态,鉴定结果如图3和表4所示。经过革兰氏染色试验后,可以看出这2株菌均为革兰氏阳性菌株。2.3.2菌种利用试验将L9和L11菌株进行生化鉴定试验,结果如表5所示,根据文献可以初步鉴定这2株菌为乳杆菌属。将L9和L11进行糖发酵试验,测定2株菌对不同碳水化合物的利用情况,结果如表6所示。根据文献[3,7],通过分析试验结果,可以初步判定L9为短乳杆菌,L11为植物乳杆菌。3发酵离心液的抑菌活性从16种酸菜汁中筛选出2株较好的产细菌素的乳酸菌菌株L9和L11,该2菌株产生的细菌素对单核细胞增