脑源性神经营养因子对抑郁症大鼠海马神经元前体细胞微管相关蛋白的影响

脑源性神经营养因子对抑郁症大鼠海马神经元前体细胞微管相关蛋白的影响

脑源性神经营养因子（nbf）是德国神经科学家在1982年从猪脑中分离的一种小分子蛋白质。人类、猪和大鼠的ddnf具有完全相同的氨基酸编码序列，以及与神经生长因子（ngf）相似的高含量序列，因此被统称为神经生长因子家族的成员。越来越多的研究发现,BDNF与抑郁症的发生密切相关,即抑郁症时脑组织及血清中BDNF含量明显下降,且BDNF表达水平的升高或降低导致了抑郁症时人或动物行为学的改变。BDNF由神经元的靶细胞分泌,可反向营养神经元,对神经细胞的生长发育和保护修复有十分重要的作用。研究证实,BDNF可影响啮齿类动物海马组织中血清复合胺的神经传递,而中枢性BDNF的缺失妨碍了成年小鼠海马新颗粒神经元的分化。通过对自杀后抑郁患者脑组织的检测显示,脑组织特别是海马、前额皮质中BDNF的减少尤为明显。在动物实验中观察到,BDNF海马内灌流能在抑郁模型动物、包括习得性无助和强迫性游泳后大鼠产生明显的抗抑郁效应。近来研究发现,BDNF和抗抑郁剂在促进成年海马齿状回细胞的更新、增殖及存活中有协同作用,但BDNF在促进海马神经前体细胞增殖中的作用似乎并不显著。事实上,BDNF对神经元前体细胞定向分化、迁移的影响鲜有报道。基于此,我们采用脑室注射BDNF作用于抑郁症模型大鼠,免疫组织化学和免疫荧光技术检测海马组织神经元前体细胞DCX阳性细胞表达水平,初步阐明BDNF在缓解抑郁症过程中的相关作用机制。1材料和方法1.1分组、注射放空首先用敞箱实验(openfieldtest)进行行为学评分,选择得分相近的成年健康SD大鼠30只,体质量(218±30.5)g,由第三军医大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后,随机分为3组:空白对照组2组,每笼5只;模型组和BDNF注射组每组10只,每组分别每笼1只单独饲养。建立大鼠抑郁症模型,具体方案如下:1)悬吊30min;2)强迫游泳6min;3)以恒温振荡器高速水平振荡30min;4)电击(1mA,时程1S,1次/分)30min;5)铁质书夹夹尾(距尾根1cm)1min;6)禁食24h;7)禁水24h。应激处理在每日上午8:30-10:30之间进行;空白对照组大鼠不予任何刺激;BDNF注射组组每只每天注射BDNF5μg,连续22d;模型组注射等量生理盐水。1.2血糖消耗实验实验前1d及实验第22天,用敞箱实验和糖水消耗实验观察各组大鼠行为的变化。具体如下:将每只大鼠置于80cm×80cm×40cm光洁敞箱中央,记录大鼠5min内在25个等边方格水平运动和垂直运动得分。禁食禁水23h后,进行糖水消耗实验,每笼同时给予2个小瓶,1个瓶装1%蔗糖水,1个瓶装纯水,60min后,计算动物的糖水消耗。在最后1次行为测定后,将全部大鼠迅速断头处死,立即取出脑组织,在冰块上分离出海马组织,置于锡箔纸内,放入液氮罐中保存待测。1.3免疫组织化学纯化的BDNF蛋白购自Sigma公司(CA,USA);Doublecortin免疫组织化学试剂盒购自英骏公司(上海,中国);萤光素FITC购自联科生物有限公司(杭州,中国);DMLS2病理图文分析系统(Leica,Germany);MZ16F荧光显微镜(Leica,Germany)1.4免疫组化检测组织行冰冻切片,片厚约20μm,取背侧海马及额叶行免疫组织化学染色。Doublecortin免疫组化染色步骤(SP法):1)PBS漂洗组织片5min×3次;2)置于0.3%H2O2甲醇液20min,以阻断内源性过氧化物酶;3)10%正常羊血清封闭20min;4)兔抗大鼠Doublecor-tin一抗37℃孵育,1h后转入4℃过夜;5)PBS漂洗3次;6)HRP标记的山羊抗兔或萤光素FITC标记二抗。37℃,2h;7)PBS漂洗,封片;8)普通光学显微镜或倒置荧光显微镜下观察。对Doublecortin染色阳性细胞进行平均光密度分析。1.5统计处理所有计量资料采用x±s。采用SPSS11.0统计软件进行数据分析,组间比较采用t检验。以P<0.05为具有统计学意义。2结果2.1dcx阳性细胞计数结果在海马神经元细胞胞浆、胞核均有表达。模型组且胞体变大,突起增多、延长至梭状;相对于未注射BDNF组,注射组大鼠海马区域DCX阳性细胞数明显增多,且与未注射组存在明显差异(P<0.05);正常对照组DCX阳性细胞表达数目最多(图1)。与BDNF注射组的存在统计学差异(P<0.05)。2.2两组染色荧光对比注射组大鼠海马区域DCX阳性细胞数明显增多(绿色荧光),且与未注射组存在明显差异(P<0.05);正常对照组DCX阳性细胞表达数目最多,与BDNF注射组的存在统计学差异(P<0.05,图2)。3神经前细胞功能抑郁症(depression)是情感性精神障碍(mooddisorder)的主要类型,是一种以显著而持久的心境低落为特征的综合征,患者主要表现为情绪低落,言语减少,精神、运动迟缓,长自责自罪,甚至企图自杀等。随着诸多应激因素(如生活节奏的加快、社会竞争的日益加剧)的增多,抑郁症的发病率呈逐年上升趋势。抑郁症的发病机制十分复杂,经典的“单胺学说”及受体理论认为抑郁的发生主要与单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)等的水平低下和相关受体的超敏有关,因而传统的临床治疗着眼于调控中枢神经系统(CNS)内单胺类递质的水平,通过应用几类抗抑郁药包括三环类抗抑郁药、选择性NE再摄取抑制剂,直接或间接增加突触间隙中的单胺类递质而进行治疗。事实上,传统的单胺类神经递质与受体理论并不能充分解释抗抑郁药的临床滞后效应;故推测单胺类神经递质的改变可能仅是抑郁发生机制中的一个信号环节或原因之一,对抑郁发生的细胞分子机制尚需深入探讨。自从Eriksson证实人类海马终生具有产生神经元的能力后,神经发生(neurogenesis)成为中枢神经疾病实验研究的热点,并被认为对包括抑郁症在内的疾病能够起潜在的补偿和康复作用。神经前体细胞(neuralprecursorcells,NPCs)是指存在于神经系统能够增殖分化成神经元、胶质细胞的神经干细胞。神经干细胞具有多种特性,可自我更新和多方向分化,具有增殖、分裂及对损伤和疾病的反应能力。NPCs的增殖、移行及分化是神经发生具体变化的一部分,正常成体脑处于原始增殖状态的NPCs呈静息状态,在缺血缺氧等诱导因素刺激下可再次增殖和分化,产生神经元和胶质细胞。BNDF是由120个氨基酸组成的一种碱性蛋白,是神经营养因子家族成员之一。其生物学效应主要由二种类型的跨膜糖蛋白介导,一种是高亲和力受体TrKB,另一种是低亲合力神经营养素受体(LNGFR),其中TrKB是信号转导所必需的。TrKB的细胞外配体结合区与BNDF结合后可发生自磷酸化,继而发生一系列底物磷酸化反应,实现从细胞膜到细胞核的信息传递而引起细胞应答效应,TrKB主要表达在脑中。国外大量文献表明,BDNF与抑郁症的发生密切相关,且升高或降低表达水平的BDNF导致了抑郁症时人或动物行为学的改变。同时,在动物实验中已经观察到了BDNF抗抑郁的效应。在我们的研究中同样发现,经BDNF注射处理过的抑郁症大鼠评分明显高于未注射组大鼠,抑郁症状和行为学明显得到改善。而经过抗抑郁药物治疗后,大鼠海马组织中BDNFmRNA水平明显升高,这也暗示了BDNF在抗抑郁症中的作用。在进一步的研究中发现,BDNF氨基酸66位缬氨酸变异为蛋氨酸后导致了双相精神障碍患者海马组织学的改变。基于此,我们采用脑室内注射BDNF作用于抑郁症大鼠,观察其对DCX表达的影响。结果发现,BDNF脑室内注射明显升高了DCX在海马神经元中的阳性表达水平。Doublecortin(DCX)是神经细胞的重要的微管相关蛋白,可作为移行的不成熟的神经元的标记物。神经元特异性核蛋白(NeuN)和胶原纤维酸性蛋白(GFAP)分别用来区别成熟的神经元和星形胶质细胞。Vreugdenhil等研究发现,表达于放射状胶质细胞中的DCX对于神经前体细胞的分化是至关重要的。DCX主要表达于迁移的神经纤维细胞,广泛存在于海马及颞皮层。有研究发现,相对于正常人,癫痫病人可见Dcx阳性细胞数量明显增多。同时,癫痫病人颞皮层Dcx阳性细胞亚群也可表达成熟神经元的标记分子NeuN。DCX可作为评价神经细胞分化和迁移的一个重要指标