考马斯亮蓝g-20显色剂变色反应的光谱法研究

考马斯亮蓝g-20显色剂变色反应的光谱法研究

蛋白质是生物中最重要的生物因素，在生命活动过程中起着非常重要的作用。这是维持生命活动所必需的物质。因此，蛋白质含量的测定对生物化学和临床医学具有极其重要的意义。1976年，brd霍首次报道了用硅蓝g-250（简称cmbg）测量微藻蛋白质的方法。由于该方法具有高度灵活动用性、特异性强、操作简单、干扰少等优点，它已被广泛应用于生物化学和临床分析。虽然关于cbbg和生物厚碳蛋白质相互作用的研究已报道，但其相互作用的机制尚未完全澄清。关于cbbg显色剂本身的颜色反应机制的实验研究很少。我们的实验室对糖和光谱检测的相互作用进行了系统研究，并提出了空间方向相互作用模型。这方面的这项研究工作为我们提供了一个完整的理论基础，以便更好地阐明cbbg和生物厚碳蛋白质相互作用的机理，进一步改进和发展蛋白质分析方法，阐明生物厚碳和光谱检测相互作用的化学性质。在这项工作中，我们使用光谱法研究了不同ph值下cmbg显色剂的吸收光谱，并研究了不同实验条件下cmbg显色剂吸收光谱的影响。实验结果表明，cbbg显色剂呈现出五种颜色变化，如蓝色、绿色和棕色，主要是由于cbbg分子之间的相互作用造成的。图1显示了康格的结构方法。1实验1.1分光光度计U-3000分光光度计(日本Hitachi公司);UV-754分光光度计(上海精密科学仪器公司);PHS-P型酸度计(上海大中分析仪器厂).考马斯亮蓝G-250(CBBG),Fluka进口分装,上海试剂采购供应站经销,其它试剂均为分析纯或优级纯.1.2反应试剂的制备因CBBG显色剂对反应体系酸度非常敏感,为了避免反应体系受酸度的影响,在保证体系酸度恒定的条件下配制以下试剂.1.2.1l95%乙醇、磷酸溶液和酸钠溶液将50mgCBBG溶解在25mL95%乙醇中,然后再加入85%磷酸50mL,用蒸馏水定容至500mL,贮存在棕色瓶中于4℃下避光保存.1.2.2不含磷酸cbbg显色剂100mg/l的制备将25mgCBBG溶解在12.5mL95%乙醇中,用蒸馏水定容至250mL.1.2.3磷酸的bbg显色剂的配制在已含有25mgCBBG,12.5mL95%乙醇的250mL容量瓶中,再加入40mL85%磷酸,用蒸馏水定容至250mL,即得含160mL/L磷酸的CBBG显色剂,然后用不含磷酸的CBBG显色剂按一定比例稀释含160mL/L磷酸的CBBG显色剂即可配制成不同磷酸浓度(20,40,60,80,100,120,140,160mL/L)的CBBG显色剂(100mg/L).1.2.4不同浓度的cbbg显色剂的配制将40mgCBBG溶解在5mL95%乙醇中,然后再加入85%磷酸10mL,用蒸馏水定容至100mL,即得浓度为400mg/L的CBBG显色剂,然后用CBBG显色剂按一定比例稀释浓度为400mg/L的CBBG显色剂即可配制成不同浓度(100,130,160,190,220mg/L)的CBBG显色剂.1.2.5cbbg显色剂的制备在已含有2mgCBBG,10mL95%乙醇的100mL容量瓶中,再加入10mL85%磷酸,用蒸馏水定容至100mL,即得含9.5%乙醇的CBBG显色剂;在已含有2mgCBBG,90mL95%乙醇的100mL容量瓶中,加入10mL85%磷酸,即得含85.5%乙醇的CBBG显色剂;然后将9.5%乙醇CBBG显色剂和85.5%乙醇CBBG显色剂分别按10∶0,9∶1,8∶2,6∶4,5∶5,4∶6,2∶8,1∶9,0∶10比例混合即可配制成不同乙醇浓度(9.5%,17.1%,24.7%,39.9%,47.0%,55.1%,70.3%,77.9%,85.5%)的CBBG显色剂(20mg/L).1.2.6不同nacl浓度的cbbg显色剂的配制在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,再加入溶解的14.610gNaCl水溶液,用蒸馏水定容至100mL,即得含2.50mol/LNaCl的CBBG显色剂,然后用CBBG显色剂按一定比例稀释含2.50mol/LNaCl的CBBG显色剂即可配制成不同NaCl浓度(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mol/L)的CBBG显色剂(100mg/L).1.2.7hp--cd的配置在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,加入1.0g羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)水溶液,用蒸馏水定容至100mL,即得含有1.0%HP-β-CD的CBBG显色剂,然后用CBBG显色剂按一定比例稀释含1.0%HP-β-CD的CBBG显色剂即可配制成不同HP-β-CD浓度(0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%)的CBBG显色剂(100mg/L).1.2.8tri能力显色剂的配制在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,加入0.5mLTritonX-100即得含0.5%TritonX-100的CBBG显色剂,然后用CBBG显色剂按一定比例稀释含0.5%TritonX-100的CBBG显色剂即可配制成不同TritonX-100浓度(0.02%,0.04%,0.06%,0.08%,0.10%)的CBBG显色剂(100mg/L).1.3扫描光谱和测定波长的确定在一系列12mm×100mm试管中,分别加入同一试剂不同浓度的CBBG显色剂4mL,摇匀,5min后,以蒸馏水为参比扫描350~800nm间的吸收光谱或在给定波长下测量吸光度.2结果与讨论2.1cbbg分子质子化反应进程图1为不同磷酸浓度下的CBBG显色剂吸收光谱.从图1可见随着磷酸浓度的增大,595nm吸收峰逐渐红移至650nm且不断下降,465nm吸收峰逐渐升高.这种光谱变化对应于CBBG显色剂产生从蓝色→绿色→棕红色等多种颜色变化.CBBG分子中含有一个季胺、一个叔胺、一个仲胺和二个磺酸基团,在低磷酸浓度条件下,CBBG分子叔胺氮和仲胺氮不易发生质子化,整个分子带负电荷,由于体系的亲水能力弱,CBBG分子间疏水作用力小于分子间斥力,分子不易聚集,为游离单体呈现蓝色,最大吸收峰在595nm;随着磷酸浓度的增大,叔胺氮逐渐发生质子化(叔胺氮pKb为5.15,仲胺氮pKb为0.79),CBBG分子呈现电中性,由于反应体系的亲水能力不断增强,对CBBG分子的疏水作用力逐渐增加,CBBG分子的芳环结构通过疏水相互作用相互聚集,形成了聚集体.此时,CBBG显色剂游离单体和聚集体共存,表现为绿色,最大吸收峰在650nm;随着磷酸浓度的进一步增大,仲胺氮也相继发生质子化,CBBG转变成完全质子化形式,整个分子带正电荷.此时反应体系的亲水能力增强,对CBBG分子疏水作用力进一步增加,使CBBG分子间的疏水相互作用增强,CBBG分子间疏水作用力大于分子间斥力,CBBG分子的芳环结构通过疏水相互作用相互聚集程度进一步增大,全部形成了CBBG聚集体,CBBG显色剂呈现为棕红色,最大吸收峰在465nm.从现象上看,随着磷酸浓度的增大,反应体系产生了从蓝色→绿色→棕红色等多种颜色变化.当磷酸浓度超过100mL/L时,反应体系静置12h后产生了聚集体沉淀.因此,我们认为CBBG显色剂随着磷酸浓度逐渐增大呈现出从蓝色→绿色→棕红色等多种颜色变化是在CBBG发生质子化的基础上,主要由疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同而引起的.CBBG的颜色变化与反应体系的酸度变化有关,Compton和Jones认为CBBG在显色液中存在三种形式即阴离子形式B、中性形式G和阳离子形式R.CBBG的解离平衡式如下:CBBG分子在pH1.25的体系中不发生质子化反应,为未质子化的阴离子形式B,呈现蓝色,其最大吸收峰在595nm,如图2a所示;CBBG中性分子G为单个胺基质子化形式,体系呈现绿色,其最大吸收峰在650nm;CBBG分子在pH0.30的体系中发生完全质子化,为完全质子化的阳离子形式R,呈现棕红色,其最大吸收峰在465nm,如图2b.Compton和Jones认为CBBG显色剂的颜色变化主要是由单体质子化引起的.2.2反应体系的绿色逐渐加深,聚集体的形成图3为固定磷酸浓度100mL/L(pH0.53),改变CBBG的浓度而绘制的吸收光谱.从图3可见,在不同CBBG浓度的反应体系中,随着CBBG浓度的逐渐增大,465nm和595nm吸收峰不断升高,但以650nm吸收峰升高的幅度最大(与465nm吸收峰升高的幅度相比较).从现象上看,反应体系的绿色逐渐加深,当CBBG浓度超过130mg/L以上时,反应体系在静置12h后会形成绿色的聚集体沉淀.这说明在磷酸浓度100mL/L的条件下,CBBG以游离单体和聚集体形式共存,随着CBBG浓度的逐渐增大,CBBG游离单体和聚集体也相应增多,但以聚集体增加显著,导致反应体系的绿色逐渐加深和聚集体沉淀的形成.在反应体系磷酸浓度不变的条件下,仅依靠单体质子化是很难解释绿色聚集体的形成.2.3不含磷酸的cbbg显色剂的颜色变化规律从图4可以看出,含磷酸的CBBG显色剂在乙醇浓度低于24.7%范围时,最大吸收波长650nm不变.但随着乙醇浓度的增加,最大吸收波长发生蓝移,当蓝移至最大吸收波长612nm时又恒定不变,且与不含磷酸的CBBG显色剂的最大吸收波长在612nm处重合.在中性条件下,CBBG在不含磷酸CBBG显色剂溶液中最大吸收波长随着乙醇浓度的增加逐渐红移,当乙醇浓度增加至39.9%以上时,最大吸收波长红移至612nm时保持不变,这可能是在中性条件下不含磷酸的体系CBBG聚集体逐渐解体成单体CBBG分子的缘故.在酸性条件下,由于随着乙醇浓度的增大,含磷酸的CBBG显色剂溶液中CBBG分子间的疏水相互作用逐渐被破坏,CBBG聚集体逐渐解体,当乙醇浓度达到70.3%时,全部解体变为单体CBBG分子.此时,含磷酸的CBBG显色剂和不含磷酸的CBBG显色剂最大吸收波长在612nm处发生重合,表明此时含磷酸的CBBG显色剂中聚集体已全部解体变为CBBG单体分子.在反应体系磷酸浓度恒定不变的条件下,含磷酸的CBBG显色剂也产生了由棕红色→绿色→深蓝色等多种颜色变化,这充分说明了CBBG显色剂产生的颜色变化主要是由疏水相互作用形成聚集体聚集程度不同所引起的.2.4显色剂的力量从图5可见,随着NaCl浓度的增加,595nm的吸光值不断下降,465nm的吸光值不断升高,导致CBBG显色剂棕红色逐渐变深.这是由于随着NaCl浓度的增加,反应体系的亲水能力增强,对CBBG分子的疏水作用力增加,使CBBG分子间的疏水相互作用增强,聚集程度不断加大,形成了CBBG聚集体,故而CBBG显色剂棕红色逐渐变深.这种实验现象与反应体系中增加磷酸浓度产生的现象完全一致,说明CBBG分子间疏水作用力在形成聚集体过程中起主要作用.2.5hp--cd包合反应体系的结构从图6可以看出,随着HP-β-CD浓度的增大,595nm的吸光值逐渐增加,465nm的吸光值逐渐下降,导致CBBG显色剂由棕色变为绿色.HP-β-CD分子具有较大的疏水空腔,与芳香族化合物进行包结反应,能破坏CBBG分子间的疏水相互作用.随着HP-β-CD浓度的增加,CBBG分子间疏水相互作用逐渐遭到破坏,部分聚集体解体变为单体.由于低浓度的HP-β-CD破坏CBBG分子间的疏水相互作用能力较弱,不能将所有的聚集体转变为单体,因此反应体系中聚集体和单体共存,CBBG显色剂只能变为绿色,不能完全转变为CBBG单体所特有的深蓝色.2.6显色剂的颜色转变图7可见,随着TritonX-100浓度的增大,595nm的吸光值逐渐升高,465nm的吸光值逐渐降低,导致CBBG显色剂产生了颜色变化,由棕色→绿色→深蓝色.TritonX-100为非离子表面活性剂,破坏疏水相互作用能力强.由于TritonX-100浓度的增大,CBBG分子间的疏水相互作用逐渐遭到破坏,CBBG聚