园艺植物组织培养

园艺植物组织培养

Tissuecultureofhorticulturalplants内容Conceptandtypesoftissueculture(TC)RoleandapplicationofTCDevelopmentofTCTCfacilityandmedium一、ConceptsofTissueculture（TC）Referstotechniqueofgrowingplantcells,tissues,organs,seedsorotherplantpartsonanutrientmediuminasterilemannerundercontrolledenvironment组织培养(Tissueculture)指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体,explants）并接种到人工培养基（medium)，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程。也叫离体培养（Invitroculture）外植体（Explants）AportionofplantremovedandusedforTC由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官Classifiedbasedon培养方式培养过程培养材料二、TypesofTC固体培养和液体培养在固体培养基(solidmedium，加琼脂的培养基)上培养在液体培养基(liquidmedium，不加琼脂的培养基)上培养液体培养又有悬浮suspension培养和静置stationery培养1、根据培养方式初代培养(primaryculture)将从植株体上分离下来的第一次培养称为初代培养Thefirstcultureaftertheexplantsareremovedfromthemotherplant继代培养(subculture)以后培养体转移到新的培养基，则统称为继代培养Culturesaftertheprimaryculture2、根据培养过程分：3、根据培养材料分愈伤组织callus培养；器官organ培养；胚embryo培养；胚珠ovule和子房ovary培养；胚乳endosperm培养；花粉pollen和花药anther培养；细胞cell培养原生质体protoplast培养（1）愈伤组织培养（callusculture）•Callus–anundifferentiatedtissue,isamassofactivelydividingundifferentiatedcellsproducedbyplanttissueexplant•Calluscanberesuspendedinliquidmediatocreateasuspensioncultureofsingletotipotentcellsordifferentiatedintoplantwiththeappropriatemanipulationsofcultureconditions原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。Callustoplant愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？原因：大部分组织培养经历callus再生途径长出植株；callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。愈伤组织培养细胞培养器官培养原生质体培养(2)器官培养(organculture)主要是roottip、shoottip茎尖、叶与未成熟果实unripeningfruit等培养。根端的离体培养是研究生物合成的一种手段茎尖培养具有快速繁殖和去除病毒的优点。主要是对较小且未成熟的胚进行培养，研究胚胎的发生以及影响胚生长的因素，特别是所需有机营养成分的研究。(3)胚培养(embryoculture)培养已传粉的子房及胚珠，是进行试管受精和诱导单倍体植株的一个途径，也是研究生殖生理的有效方法。UsedforfertilizationintubesandinductionofhaploidplantsUsedforstudiesofreproductivephysiologyandmolecularbiology(4)胚珠和子房培养(ovuleandovaryculture)：是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系以及获得无籽结实的三倍体植株的手段。Usedforstudiesoffunctionofendosperm,relationshipbetweenendospermandembryoUsedforproductionoftriploidsthatareXX(5)胚乳培养(endospermculture)seedless利用花粉具有整套染色体的特点，诱导产生单倍体haploid植株进行育种，可以缩短育种周期shortenbreedingcycles，获得纯系pureline。(6)花粉和花药培养(embryoculture)分散性好的离体细胞或细胞团的培养，可应用于生产提取某些有用成分和次生物质，单细胞培养还可用于取得单细胞无性系，进行突变体选育。ProductionofsecondarymetabolitesClonalvariation:somaclonalvariationforselectionofsuperiormutants(7)细胞培养(Cellculture)将去壁后裸露的原生质体进行培养。易于摄取外来遗传物质，细胞器及病毒、细菌，应用于体细胞杂交或外源基因的导入研究。UptakeofforeignDNA,cellfusion(8)原生质体培养(protoplastculture)三、组织培养的意义基础研究育种上的应用离体保存1、基础研究方面营养生理nutritionalphysiology细胞生理和代谢cellphysiologyandmetabolism基因重组generecombination新的技术手段newtechniques生物合成biologicalsynthesis加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因花培获得单倍体加倍获得纯合二倍体homozygousdiploidsafterdoublingofhaploid离体培养结合离体诱变加速获得突变体mutagenesisinvitrotoexpeditethemutantproduction克服远缘杂交不亲和的障碍overcomethebarriersofremotecrosses，促进幼胚发育胚培养。创造新的种质creationofnewgermplasms花药培养细胞融合胚乳培养体细胞无性系变异（somaclonalvariation）2、育种方面SomaclonalVariationinVitroVariabilityinplantsregeneratedfromtissueculturethatiseitherinducedoruncoveredbyatissuecultureprocess.Mostsomaclonalvariationisnegative,butifenoughplantsareexamined,positivechangescanusuallyberecovered.Somaclonalvariationisageneralphenomenonofallplantregenerationsystemsthatinvolveacallusphase.InducingMutationsPhysicalMutagens(irradiation)Neutrons,AlpharaysDenselyionizing(“Cannonballs”),mostlychromosomeaberrationsGamma,Beta,X-raysSparselyionizing(“Bullets”),chromosomeaberrations&pointmutationsUVradiationNon-ionizing,causepointmutations(ifany),lowpenetratingChemicalMutagens(carcinogens)ManydifferentchemicalsMostarehighlytoxic,usuallyresultinpointmutationsSomaclonal/MutationBreedingAdvantagesScreenveryhighpopulations(cellbased)CanapplyselectiontosinglecellsDisadvantagesManymutationsarenon-heritableRequiresdominantmutation(ordoublerecessivemutation);mostmutationsarerecessiveTargetsforSomaclonalVariationSeedlessness,maturationtime:citrusHerbicideResistanceandToleranceSpecificaminoacidaccumulatorsScreenforspecificaminoacidproductionLysineincerealsAbioticstresstolerancesalttolerance,temperaturestresses,etc…DiseaseresistanceDiseaseResistantSuccessusingSomaclonalVariationCropPathogenToxinAlfalfaColletotrichumsp.CulturefiltrateBananaFusariumsp.FusaricacidCoffeeColletotrichumsp.PartiallypurifiedculturefiltrateMaizeHelminthosporiummaydisT-toxinOat*HelminthosporiumvictoriaeVictorinOilseedRape*PhomalingamCulturefiltratePeachXanthomonassp.CulturefiltratePotato**PhytophthorainfestansCulturefiltrateRice*XanthomonasoryzaeCulturefiltrateSugarcane**Helminthosporiumsp.CulturefiltrateSugarcane**HelminthosporiumsachariPartiallypurifiedHStoxinTobacco*PsedomonastabaciMethionine-sulfoximineTobacco*AlternariaalternataPartiallypurifiedtoxin*Showntobeheritablethroughsexualpropagation**ShowntobestablethroughvegetativepropagationSourcesofsomaclonesincitrus:

organogenesis,somaticembryogenesis,protoplastsSWEETORANGEORGANOGENESISADVENTITIOUSSHOOTBUDINDUCTIONCallusSWEETORANGEPROTOPLASTSORNAKEDCELLSVariableTraitsObservedinHamlinandValenciaSomaclones*alteredtreesizeandarchitecture*maturitydate*seedcontent*juicecolor*juice%*solublesolids*acidcontent*fruitsize*peelability*flavor

VALENCIAWITHALTEREDCANOPYARCHITECTUREVALENCIASOMACLONEWITHFRESH-MARKETPOTENTIALVALENCIASOMACLONES-INTERNALAPPEARANCEWatermelonwithincreasedsizeAsingleexplantcanbemultipliedintoseveralthousandplantsinlessthanayear-thisallowsfastcommercialpropagationofnewcultivars快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。获得无病毒(virus-free)苗木。3、RapidpropagationandviruseliminationMicropropagationTheartandscienceofplantmultiplicationinvitroUsuallyderivedfrommeristems(orvegetativebuds)withoutacallusstageTendstoreduceoreliminatesomaclonalvariation,resultingintrueclonesCanbederivedfromotherexplantorcallus(buttheseareoftenproblematic)MicropropagationgenerationofgeneticallyidenticalplantsStepsofMicropropagationStage0–Selection&preparationofthemotherplantsterilizationoftheplanttissuetakesplaceStageI

-InitiationofcultureexplantplacedintogrowthmediaStageII-Multiplicationexplanttransferredtoshootmedia;shootscanbeconstantlydividedStageIII-RootingexplanttransferredtorootmediaStageIV-Transfertosoilexplantreturnedtosoil;hardenedoff马铃薯试管种快繁Strawberrymicropropagation草莓试管苗直接移栽到穴盘中经过精心管理，获得三叶一心可以田间定植的草莓原种苗标准苗返回4、

GermplasmPreservation种质保存Slowgrowthtechniques↓Temp.,↓Light,mediasupplements(osmoticinhibitors,growthretardants),tissuedehydration,etcMedium-termstorage(1to4years)CryopreservationUltralowtemperatures(-196oC).Stopscelldivision&metabolicprocessesVerylong-term(indefinite?)三、组织培养的发展简史探索阶段（1902-1929年）组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年）细胞全能性的证实阶段（1940-1959）组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）组培技术在生产上广泛应用阶段（1980-今）五个阶段探索阶段（1902-1929年）GottliebHaberlandt：观点：贡献：提出细胞全能性Totipotencyistheabilityofaplantcelltoperformallthefunctionsofdevelopment,abilitytodevelopintoacompleteplant.

首次进行离体细胞培养thefirstonetodoinvitrocellculture高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞tissueororgansofhigherplantscanbeseparatedintosinglecells首次进行离体细胞培养HaberlandtreportedcultureofisolatedsinglepalisadecellsfromleavesinKnop'ssaltsolutionenrichedwithsucrose.Thecellsremainedaliveforupto1month,increasedinsize,accumulatedstarchbutfailedtodivide.Effortstodemonstratetotipotencyledtothedevelopmentoftechniquesforcultivationofplantcellsunderdefinedconditions.

小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素

Highlydifferentiated,nogrowthregulatorsKnop+蔗糖《关于单离植物细胞培养实验》我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。在未来，人们可以成功地从营养细胞培养出人工胚。1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株1922年：Kotte和Robbins根培养1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种interspecifichybridembryo其它研究1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花orchid幼苗，克服其种子发芽困难的问题。2.组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年）1934年：White由番茄根建立第一个无性系，根离体培养真正成功1934年：RJ.Gautheret培养山毛杨形成层poplarcambium组织,Callus1937年：White发现3种B族维生素vitamin和IAA对植物生长有用1939年：Gautheret培养胡萝卜根小外植体成功1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功

roottuberparenchymatissueRJ.Gautheret/FranceP.R.White/USA.

Nobecourt/France3.细胞全能性的verification（1940-1959）1943年：White:AHandbookofPlantTissueCulture,landmarkofTC1948年,SkoogandCuireported:highadenine/auxinratioisrelatedtoshootdevelopment,lowisrelatedtoroots培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，腺嘌呤/生长素高，生芽；低，生根1956年：Miller分离出激动素Kinetin，Kinetin/生长素3.细胞全能性的证实阶段（1940-1959）1952年，Morel和Martin:cultureofshoottipmeristemgaverisetovirus-freedahliaplants首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株1953年：Muir等首次进行烟草Callussuspensionculture振荡培养，successinsinglecellculture单细胞培养成功3.细胞全能性的证实阶段（1940-1959）1958年：Stewardobtainedembryoidsfromsuspensioncultureofcarrot在胡萝卜细胞悬浮培养中得到胚状体，证明了植物细胞完整性。4.组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。Antherculture1964年,Guha和Maheshwari(UniversityofDelhi,India),succeededingettinghaploidsbyanthercultureinDaturainnoxia毛叶蔓陀罗Itwasanaccidentalobservationduringtheperiodiccleaningofthecultureroom.Theynoticedthatstructuresresembledembryoshadarisenfromtheculturedanthersinfewinstances.Thiswasanunexpectedandexcitingdiscovery(Maheshwari,1996)sofar,tobacco、rice、wheat、maize、apple、barley、tomato、pepper、strawberry、等作物中获得成功我国用花药培养获得了小麦、水稻、玉米、油菜、果树、甜椒、烟草等作物的新品种，累计推广面积超过10000公顷，是世界上花培品种应用最多的国家花培植株富85-1Otherimportantevents1960年：Cockingsucceededinisolatingprotoplastsusingenzymes酶解法分离原生质体获得成功1971年：Takebe&Nagataobtainedprotoplast-derivedplantsforthefirsttime首次培养烟草原生质体获得植株1972年：Carlsonetal.obtainedsomatichybrids得到烟草种间体细胞杂种组培新品种新种质快繁脱毒5.组织培养在生产上广泛应用阶段（1980年-今）TimelineofPlantTissueCulturePriorto1750Plantsusedforfood;Plantsdomesticated,selectivelybredfordesiredcharacteristics1838MJSchleidenhypothesizedcelltheory,suggestingtotipotentialityofcells1902GHaberlandtmadethefirst(butunsuccessful)attemptattissueculture;WalterSutoncoinedtheterm"gene"andproposedthatchromosomescarrygenes(factorsthatMendelsaidthatcouldbepassedfromgenerationtogeneration)1934RJGuatheretunsuccessfullyculturedcambialtissuesoftreesandshrubs;PRWhitemaintainedlong-termculturesoftomatoroots;Kogletalidentifiedthefirstplantgrowthregulator,IAA1939Successfulcontinuouslygrowingcambialculturesofcarrotandtobacco.1952Firstvirus-freeplantsproducedfrommeristemculture;firstsuccessfulmicrografts(MorelandMartin);1960Enzymaticdegradationofcellwallstoobtainlargenumbersofprotoplasts(Cocking)1964ProductionoffirsthaploidplantsfrompollengrainsofDatura(GuhaandMaheshwari)1971Regenerationoffirstplantsfromprotoplasts(Takebeetal)1972FirstreportofinterspecifichybridizationthroughprotoplastfusionintwospeciesofNicotiana(Carlsonetal);RestrictionfragmentscanbejoinedbyDNAligaseregardlessoftheiroriginiftheyarecutwiththesamerestrictionenzyme(MertzandDavis;Berg);Isolationofreversetranscriptase(Temin)?技术的发展

Developmentofthetechnique（一）材料范围的逐步扩大器官组织、细胞、原生质体低等苔鲜高等植物（二）培养方法的逐步发展静止液体振荡或旋转――改善O2――悬浮培养、深层培养小量大量试管大罐手工自动化（三）培养基的逐步改进随着化学工业发展而迅速发展各种配方以成品方式出售（四）实验手段的逐步完善新型显微镜microscope新型分子标记molecularmarkers新型倍性分析仪（FCM）Microscopes场发射环境扫描电镜

扫描电镜

RAPDSSRtrnD-trnT/Hae2CAPSAFLPRFLPFCManalysisofploidy三、组织培养与园艺科学的关系园艺植物良种繁育学propagation园艺植物育种学breeding园艺植物基础学科Fundamentalsciences1、组培与园艺植物良种繁育学无性繁殖组织培养慢快有病毒去病毒Asexualpropagation2、组培与园艺植物育种学传统方法芽变选种和杂交育种组织培养细胞水平上进行突变体筛选试管授精克服杂交不亲和胚培养克服胚败育胚乳培养得到三倍体原生质体培养与融合种质资源离体保存细胞水平上转基因补充Budsportsandcrosshybridization3、组培与园艺植物基础学科植物学botany生物化学biochemistry微生物学microbiology细胞生物学cytobiology植物生理学Plantphysiology植物病毒学组织培养提供基础知识提供研究平台•全能性（Totipotency）形态发生途径四、组织培养原理•theabilityofundifferentiatedplanttissuestodifferentiateintofunctionalplantswhenculturedinvitro1、Totipotency2、形态发生的类型和特点继续发育重新发生器官发生途径organogenesis胚胎发生途径Somaticembryogenesis(1)、继续发育指分化过程已完成，仅继续发育成为更完整、更成熟的新个体。Cultureofyoungembryoforovercomingincompatibilityencounteredinsomecrosses1925年Laibach等首先将胚培养用于育种，成功获得亚麻属不同种间杂种植株(2)、器官发生Organogenesis外植体愈伤组织分生细胞团器官原基或器官器官发生的3种方式1．通过茎尖shoottip培养产生大量腋芽axillarybuds植物茎尖部分是分生组织区meristematiczone，是产生植物组织地上部分的全能性区域。叶腋分生组织受到顶端优势（ApicalDominance）的抑制，而调整细胞分裂素浓度，可以促进腋芽的生长。培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。腋芽增殖2．通过器官培养直接诱导不定芽Tulipbulbproducedafter6monthswithyoungflowerstalksarethestartingmaterial在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。在顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽．从现存芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽特点：繁殖系数高，遗传稳定性较好geneticallystable。但继代次数有限。不定芽增殖Adventitiousbuds3．通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽接种的组织或器官小块在培养基上生长，去分化形成愈伤组织；为诱导愈伤组织生长，采用较强的生长素浓度。高细胞分裂素浓度的培养基才会分化产生不定芽，且有的在不含生长素的培养基上也可以分化。器官原基或器官不定芽的形成不定根的形成2-1、不定芽的形成大部分起源于愈伤组织表面或近表面的分生细胞团，故也叫外源发生externaldevelopment2-2、不定根的形成大多数发生在较深层的愈伤组织中，故也叫内源发生，通常与芽相对方向生长，产生根原基先根后芽2-3、根芽形成的顺序在愈伤组织上先形成根，然后在根上长芽2-3、根芽形成的顺序先芽后根在愈伤组织上先形成芽，然后在芽上长根2-3、根芽形成的顺序在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后二者合起来形成一棵完整植株2-3、根芽形成的顺序在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后二者合起来形成一棵完整植株2-4、器官发生的特点根和芽为单极性的根和芽中有维管束vascularbundle与愈伤组织相连，以获得营养芽起源于多细胞multicellularorigin(3)、胚胎发生Embryogenesis在愈伤组织表面或内部产生胚状体（体细胞胚，somaticembryo）的过程类似于合子胚的发生，有球形胚、心形胚、鱼雷形胚和心形胚四个时期球形胚心形胚鱼雷胚子叶胚Globaularheart-shaped

torpedocotyledonary胡萝卜体胚发生3-1、胚胎发生的特点(3)胚胎发生是双极性的；维管束是独立的；起源于单细胞3-2、胚胎发生的优点数量多；速度快；结构完整五、EstablishmentofalabDesigningofalabEquipmentofalab一、Designingofalab洗涤室（区）washing制备室（区）preparation灭菌室（区）sterilization贮放室（区）storage操作室（区）manipulation培养室（区）cultureroom观察室（区）observation药品室（区）chemicals标准组织培养室植物组织培养实验室设计

平面图洗涤室制备室灭菌室操作室药品室培养室观察室过道贮存室1、洗涤室（区）玻璃器皿glassware和塑料器皿自来水洗洗液重铬酸钾和浓硫酸混合液洗涤剂detergent洗干自然晾干烘箱干燥12PotassiumdichromateOilofvitriolconcentratedsulfuricacid洗涤区2、药品室存放常用的化学试剂无机盐类、有机物、生长调节剂等Inorganicsalts,organicmatter,PGR培养基的配制medium生理生化测定Physiologicalandbiochemicalmeasurement3、制备室4、贮存室（区）存放配后的培养基或未用完的培养基5、灭菌室培养基、玻璃器皿、塑料器皿和其它物品消毒室disinfection6、操作室接种室开展组织培养研究接种、继代、细胞融合等7、培养室培养材料所用8、观察室组织培养中显微观察显微镜室9、移苗室组织培养材料移到田间前，先移到移苗室进行炼苗，待生根成活后，再移到田间苗辅圃二、仪器和设备1、烘箱heatingoven干燥洗后的器皿drying高温干热灭菌测定培养物的干重时DW气浴airbath陈列于洗涤室中2、冰箱陈列于制备室中存放药品、培养基母液、激素、酶制剂低温保存材料冰箱超低温冰箱3、灭菌锅autoclave培养基、蒸馏水和各种器皿的消毒普通医用消毒锅大消毒锅活性成分过滤灭菌接种工具随时消毒培养基灭菌玻璃器皿灭菌4、超净工作台laminarflow/

streamline

flow垂直式和水平式Verticalandhorizontal无菌操作用sterilizer5、酸度计pHmeter测定培养基及酶制剂的pH值6、摇床shaker陈列于培养室中悬浮培养、振荡培养SuspensioncultureGyratoryculture7、显微镜倒置显微镜inverted普通过显微镜compound荧光显微镜fluorescence解剖显微镜Stereomicroscope原生质体观察染色体和叶片气孔观察细胞活力viability观察立体观察（胚）倒置显微镜体视显微镱普通显微镱8、天平balance/scale称取大量元素macro-element、微量元素micro-element、酶enzyme制剂等9、培养箱growthincubator培养材料培养箱三、玻璃器皿及用具glassware1、玻璃器皿培养用显微镜下观察用细胞微室载玻片glassslide培养皿petridish试管testtube三角瓶conicalflask培养皿等petridish2、微孔过滤器filtersterilizer灭菌用：激素3、细胞计数器/血球计数板Hemocytometer统计培养细胞的数目4、接种用具镊子、剪刀、解剖刀、接种针、接种铲Forceps\scissor\scalpel\Inoculationneedle\shovel四、培养条件光照、温度、湿度、气体成分1、光照条件光照强度intensity时间长短period光照质量quality有的材料培养需要光，有的则不需光不同植物种所需光照强度不同，1000-5000Lux/12-16h/天光照会分解生长素2、温度条件3、湿度条件23-32oC/25optimal4、气体培养基的种类培养基的成分培养基的配制五、培养基及制备1、培养基的种类按性质分基本培养基完全培养基MS、MT、White等基本培养基+其它成分MurashigeandTuckerMurashigeandSkoog激素、有机物质等按状态分固体培养基液体培养基培养材料与培养基接触不充分有毒物质容易积累污染局部通气好培养材料与培养基接触充分有毒物质不容易积累污染全部通气不好SolidmediumLiquidmedium2、培养基的成分无机盐inorganicsalts激素PGR有机物质organic琼脂agar碳源carbon大量元素macro微量元素micro2-1、大量元素N、P、S、K、Ca、MgN：各种氨基酸aminoacid、维生素vit、蛋白质protein和核酸NA的重要成分Ca：细胞壁稳定cellwallMg：酶及辅酶的成分enzyme/co-enzymeFe、Mn、B、Zn、Cu、Mo2-2、微量元素用量少，过多容易导致中毒2-3、激素细胞分裂素cytokinin赤霉素gibberelin生长素auxin促进细胞分裂和分化不定芽，抑制根的生长，6-BA、KT、ZA、2iP诱导细胞的分裂和根的分化IBA、IAA、NAA、2,4-DIBA、IAA和IAA诱导生根，2,4-D诱导愈伤组织对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进抑制愈伤组织形成，促进芽的形成，生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。生长素/细胞分裂素：低促进芽形成生长素/细胞分裂素：高促进根形成几种激素的配制方法生长素细胞分裂素赤霉素95%的酒精或0.1mol/L的NaOH或KOH0.5或1mol/L的HCl+微热溶于水，pH5.7但不稳定，用95%的酒精IAA母液（stocksolution）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120

C稳定保存1小时，但IAA可以被低pH、光、氧和过氧化物破坏。NAA和2,4-D比IAA稳定。CTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。KT和ZT在120

C处理1小时仍能稳定存在，BA100

C时20分钟。在碱性条件下，GA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GA也变成无活性的形式。GA热不稳定，114

C处理20分钟降低其活性达90%，母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。2-4、有机物质(Vitaminsandaminoacids)VitB1VitB6VitB3VitB5肌醇CHLHMEYE硫胺素盐酸吡哆醇烟酸泛酸钙水解酪蛋白(caseinhydrolysate)水解乳蛋白(lactoalbuminhydrolysate)麦芽提取物(maltextract)酵母浸出物(yeastextract)促进细胞对培养基的反应Functionofvitamin维生素C：可防止组织变褐；维生素B1：与愈伤组织的产生和生活力有密切关系；维生素B6：对根的生长有促进；烟酸：对植物代谢和胚的发育有作用。2-5、固化剂（gellingagent）琼脂来于seaweed对植物组织有一定的生理作用用量一般为7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。其它gellingagent：Gelrite（脱乙酰吉兰糖胶）：透明，Pseudomanas种发酵产物（多糖）成分稳定。StationerysupportsWhenstationerysupportsareneededgellingagentcanbeused.Butpleasebearinmindthatgellingagentisnottheonlymeasurethatworksforstationerypurpose.Othersarefilterpaper,cotton,cheesecloth,vermiculiteandspecialmembraneraftswithinaliquidmedium滤纸桥2-6、碳源营养物质渗透压稳定剂osmoticumstabilizer类型蔗糖、葡萄糖glucose、果糖fructose、山梨醇sorbitol、麦芽糖maltose、淀粉starch等浓度2-5%（W/V）低浓度适合于原生质体培养高浓度适合于胚和花药培养作用蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成蛋白黑素，抑制细胞生长其它2-7、抗生物质antibiotics防止内生菌，可加抗生物质。Hypocotylsofpapayawerecontaminatedbyendogenousbacterium褐化browningpH计3、培养基的pH-pH值：5.5~6<5.5：theagarwillnotgelproperly>6：thegelmaybetoofirm灭菌后pH会降低0.6-1.3培养材料降低pH：产生有机酸，N利用-测定方法pH试纸pH计-pH调整方法1N的HCl和NaOH在加入agar前调pH4、培养基的选择、配制和保存（1）选择择材料和种类而异参考前人的研究MS培养基最为基本：高浓度的N、K和NH4+自己试验（2）配制程序配母液（Stocksolution)取样加成分测pHok1.为减少工作量，一般配制所需浓度高10-100倍的母液；2．配制母液，按所使用药品的类别，分别配成大量元素、微量元素、维生素等；3．保存：无机成分在一起时，可能产生沉淀，应分别保存；4．要用重蒸馏水，等级较高的化学纯或分析纯的药品，称量或定容要准确；5．配好的母液瓶上注明母液号、配制倍数、日期、及配1升培养基时应取的量。6．低温下可保存几个月。（3）母液配制和保存大量无素微量无素浓缩10倍（量加大10倍）在配制1L培养培养基时，只取

?ml浓缩100倍（量加大100倍）在配制1L培养培养基时，只取

ml母液stock的配制以KNO3为例1L培养基需要量为19g。在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液中的浓度为

g/L，即g/ml在配制培养基时，取

ml，

ml×

g/ml=

g以KNO3为例1L培养基需要量为19g。在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液中的浓度为190g/L，即0.19g/ml在配制培养基时，取100ml，100ml×

0.19g/ml=19g（4）培养基分注1．灭菌前分2、灭菌后分，三种方法：虹吸式、滴管方法、漏斗；3．分注适量，一般占试管或三角瓶的1/3～1/4；4．不要把培养基粘到管壁；分注后马上用棉盖塞住，并做好标记。5、无菌技术培养基灭菌器皿试材和接种工具的灭菌培养室和接种室的灭菌真菌污染长孢子真菌污染长孢子污染的情况细菌污染长菌落细菌污染长菌落(1)、无菌室培养室和接种室室内灭菌可用2%新洁尔敏擦洗75%乙醇喷雾UV照射20分钟2、培养基灭菌方法有高温高压蒸气灭菌过滤灭菌121°C，1.1kg/cm2,15-20分钟，时间过长，培养基成分易变性失效在高温高压下易分解的培养基和激素类3、器皿和接种工具的灭菌解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干热灭菌法，用烘箱灭菌，120°C时1小时4、外植体的灭菌充分灭菌，但不能损伤外植体不同外植体，灭菌要求不一样原则常用方法75%乙醇氯化汞（升汞）次氯酸钠表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸30秒常用浓度0.1%处理5-10分钟，有残毒浓度2-10%，时间15-30分钟，对植物无害本章思考题概念：组织培养、体细胞无性系变异、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体保存等简答题：简述组织培养室的基本设施；简述培养基配制的基本流程、应注意哪些方面？简述组织培养技术主要有哪些应用？要点1．举例说明国际上常用的几种培养基？2．培养基一般由哪些成分组成，各成分有何作用？3．培养基的配制程序？4．生长素、GA3、细胞分裂素在培养中主要有哪些作用？园艺植物花药培养重要的意义获得纯系育种材料和进行单倍体育种,以利用杂种优势,缩短育种年限和提高育种效率;纯合二倍体材料进行果树遗传变异规律研究,使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据;克服远缘杂种的不育性,获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种;远缘杂交F1代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究;花药培养建立的双单倍体(doubled

haploid,DH)群体,是果树理想的作图群体和重要的测序材料。园艺植物花药培养现状园艺植物的花药培养始于20世纪70年代柑橘苹果李扁桃荔枝枇杷黄瓜芦笋番茄西瓜辣椒花椰菜影响花药培养的因素基因型：小孢子发育时期草莓：单核中期和单核靠边期的花粉具有较高的胚状体诱导率。基本培养基芸薹属蔬菜：MS和B5草莓：MS、White碳源、激素、附加成份预处理方法：低温、离心、高温和预培养目的：从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育途径。FeaturesofAnther/MicrosporeCultureRiceplantregenerationfromanthercultureChromosomenumbersofhaploidplantscanbedoubledwithcolchicinetreatmenttoobtaindoubledhaploidplants(DHplants).TheDHlineisgeneticallyuniformedanditisusedinmanywaysinbreedingprogramsListofSomeofDHCultivarsReleasedinChinafrom1996to2004NameofcultivarNameofinstituteYearofficiallyreleasedMethod(cross)descriptionSignificantcharactersimprovedOryzasativaL.(rice):12ⅡYou162SichuanAgricUniv.1997F1hybrid:Ⅱ-32AxShuhui162RestoringlineShuhui162wasbredfromF1hybridbyDH.Thishybridhascultivatedtotallymorethan2millionha.by2000.Highgrainyield(9-12t/ha)Goodcookingquality.DYou162SichuanAgricUniv.1996F1hybrid:DShanAxShuhui162RestoringlineShuhui162wasbredfromF1hybridbyDH.GrainyieldZhonghua14Inst.ofCropBreed,CAAS2000BredfromF1hybridbyDH.DoughttoleranceLongjing7InstofRice,HeilongjiangAAS1998BredfromF1hybridbyDH.Highyield,diseaseresistenceLongjing8InstofRice,HeilongjiangAAS1998BredfromF1hybridbyDH.ColdtoleranceLongjing10InstofRice,HeilongjiangAAS1998BredfromF1hybridbyDH.Highyield,cookingqualityⅡYou802Inst.ofNuclear&Biotech,SichuanAAS1996F1hybrid:Ⅱ-32AxChuanhui802RestoringlineChuanhui802wasbredfromF1hybridbyDH.Thishybridhascultivatedtotallymorethan1millionha.by2000.HighyieldFuyou802Inst.ofNuclear&Biotech,SichuanAAS1998F1hybrid:Fu74AxChuanhui802Goodadaptability,cookingqualityGanwanxian27InstofRice,JiangxiAAS1997BredfromF1hybridbyDH.HighyieldGanzaoxian45InstofRice,JiangxiAAS1998Bredfrom“Zaozhengzhu”byDH.SuperearlinessHuayou63FujianAgricUniv1998F1hybrid:Hua1AxMinghui63MalesterilelineHua1AwasbredbyDHandapprovedin1997.Goodgrainquality,grainyieldJinliangyou36FujianAgricUniv2000F1hybrid:Hs-3x36MalesterilelineHs-3wasbredbyDH.HighyieldTriticumaestivumL.(wheat):7Jimai42Inst.ofCropBreed,HebeiAAS1998BredfromF1hybridbyDH.HighyieldListofSomeofDHCultivarsReleasedinChinafrom1996to2004Yumai60Instofwheat,HenanAAS1999BredfromF1hybridbyDH.Multi-resistanceShannong757Centerofwheatresearch,ShaanxiAAS1997BredfromF1hybridbyDH.Thiscultivarhascultivatedtotallymorethan1millionha.by2000.Highyield,droughttoleranceHua521Inst.ofCropBreed,HebeiAAS2000BredfromF1hybridbyDH.Droughttolerance,rustresistanceKuihua2InstofNongqiAgricSci.,Xinjiang1998BredfromF1hybridbyDH.HighyieldandyieldstabilityShannong78Centerofwheatresearch,ShaanxiAAS;InstituteofCropScience,CAAS2002BredfromF1hybridbyDH.Highyield,finequalityH6756InstituteofCropScience,CAAS2004BredfromF1hybridbyDH.Salttolerance,finequality,highyieldHordeumvulgareL.(barley):2Dan2InstofGenetics,CAS1997BredfromF1hybridbyDH.Goodquality,highyieldHua-30CenterofBiotech,ShanghaiAAS1999BredfromF2hybridbyDH.HighyieldBrassicanapus(rapeseed):4Huayou3CenterofBiotech,YunnanAAS1997BredfromF1hybridbyDH.Earliness,oilqualityHuayou4CenterofBiotech,YunnanAAS1998BredfromF1hybridbyDH.HighyieldHuayou5CenterofBiotech,YunnanAAS1999BredfromF1hybridbyDH.Highyield,oilqualityHuayou6CenterofBiotech,YunnanAAS2000BredfromF1hybridbyDH.Highyield,oilqualitySolanumtuberosumL.(Potato):1Gannongshu2GansuAgric.Univ1999BredfromsolanumtuberosumbyDHwithwidecross.Starchcontent,droughttoleranceHeightreductioninricehaploids[controlwildtypePokkali(centre)]Uptonowmorethan200cultivars,hybridsorlineshavebeenselectedfromDHplantsderivedfromantherormicrosporecultureinEuropeandChinaResearchstrategyofinvitroinductionandselectionproceduresofsalt-tolerantmutantsofwheatExplants:anthersoryoungspikesCallusinductionundersalt-stressedconditionRadiationtreatmentwithproperdoses(100-150Gy)Differentiationundersalt-stressedconditionRegeneratedplantletsSeedpropagationfor1-2generationswithoutsalt-stressSelectionandidentificationformulti-generationsinnaturalsalinesoilObtainingstableandinheritablesalt-tolerantmutantsPhysiologicalandbiochemicalidentificationinthelabNewMutantsforSaltToleranceH112CKH89NewMutantsforSaltTolerance0.73%NaClEmbryoCultureEmbryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidnotoccur;EmbryoCultureEmbryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidn