肿瘤标志物在肿瘤病理特征中的表达

肿瘤标志物在肿瘤病理特征中的表达

肿瘤分子特征在肿瘤诊断、入侵和转移、疗效评估和预后预测方面发挥着重要作用。人类基因组计划的实施和基因芯片和蛋白质组学技术的应用,发现了大量肿瘤相关新基因,阐明新基因在肿瘤临床诊断和预后预测中的作用,筛选新的肿瘤早期诊断和预后预测的分子标志物,迫切需要新技术能大规模和高通量地研究这些新基因在成百上千例肿瘤的不同发展阶段、不同分化程度和其相应正常组织中的表达。而组织芯片技术为从成千上万的侯选基因中筛选到与某一疾病类型特异相关的分子标志物提供了新的高通量工具。组织芯片是继基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成员,能够有效利用成百上千份正常或处于疾病状态下的组织标本分别在基因、转录和翻译水平上进行研究。本文对组织芯片技术在筛选肿瘤分子标志物中的应用现状和进展做一简要综述。1组织芯片技术的概论1.1组织芯片co-微阵列组织芯片的基本概念来源于1986年Battifora对制作具有多肿瘤组织蜡块的方法进行了全新改进,通俗称之为香肠蜡块(“sausageblock”),该方法是不规则地放置大量肿瘤组织标本于受体蜡块中。1998年Kononen等首次对组织芯片技术进行了定义。组织芯片(tissue-chip)又称组织微阵列(tissuemicroarray,TMA),是从许多供体蜡块中凿出的圆形供体组织以微阵列方式重新排列在受体蜡块上,一个受体蜡块常可容纳400~1000个直径为0.6~2.0mm的供体组织。组织微阵列可用于各种原位表达研究。1.2本研究标本一般按照样本数目的多少,将组织芯片分为低密度组织芯片(200点)、中密度组织芯片(200~600点)和高密度组织芯片(>600点)。组织芯片一般含有50~800例标本。根据研究目的不同,组织芯片可以分为肿瘤组织芯片、正常组织芯片、单一或复合型组织芯片,以及特定病理类型组织芯片等。肿瘤组织的组织芯片又可分为多肿瘤组织芯片、肿瘤进展和预后组织芯片。多肿瘤组织芯片由不同组织类型的各种肿瘤标本组成,用于检测在不同肿瘤类型组织中目的基因的表达改变。肿瘤进展组织芯片用于研究在某一特定肿瘤不同病变阶段中目的基因的表达改变;预后组织芯片是包括患者临床随访以及临床终结资料的组织芯片。1.3组织芯片的研究一个普遍关心的问题是在组织芯片中小供体组织用于基因原位表达分析是否能替代常规的肿瘤组织标本提供有意义的研究结果。已有多个研究中心对常规的组织切片与组织芯片切片进行对比研究,并对同一组织中凿取1条供体组织与10条供体组织进行对比研究。研究证实0.6mm大小的供体组织可以代替常规组织切片,其结果的一致率达95%(2个供体组织)和99.5%(5个供体组织)以上。另有研究表明,常规福尔马林固定、石蜡包埋的存档组织标本用于构建组织芯片、用于基因原位表达的研究是非常有效的。对于高度异质性的肿瘤组织标本,0.6mm大小的组织标本并不能完全获得所有源于常规大标本中的信息,组织芯片的研究结果与常规肿瘤组织切片的结果存在一些差异。尽管如此,有临床应用价值的一些分子标志物在肿瘤组织中的表达常是相对均一性,因此,组织芯片是适宜于检测这些重要的已知或具有潜临床意义的分子靶点。为了增加组织标本的代表性,从同一肿瘤患者的石蜡包埋的不同组织标本或转移部位的组织标本中凿取供体组织制作的组织芯片的有效性往往超过常规肿瘤组织切片。1.4rt-pcr和原位微织构各组的互联互通组织芯片不但克服了传统病理学方法和DNA芯片技术中存在的某些缺陷,而且可与传统的病理技术、组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR和原位DNA合成等技术相结合,提供大规模、高通量、快速地在原位组织中对基因的DNA扩增、mRNA的表达丰度和蛋白质的表达水平进行检测。组织芯片高通量、多样本、经济省时、降低误差、便于设计实验对照、可与其它生物技术相结合、用途广泛等优点是其日益受宠的原因。尽管组织芯片制作仪价格昂贵,组织芯片技术本身也存在一些缺陷,但一些新型简洁的组织芯片制作仪器和相关技术的发明,极大地降低了制作成本并促进了组织技术的推广应用。2联合基因芯片和药物组织芯片技术已广泛应用于人类肿瘤的研究中,组织芯片技术在研究肿瘤相关基因的生物学功能及筛选肿瘤相关标志物等方面发挥了重要作用,与基因芯片联合可用于新的肿瘤候选基因的筛选;与FISH和ISH等联合可用于基因水平的肿瘤标志物的筛选;与免疫组化联合可用于蛋白水平的肿瘤标志物的筛选。目前,组织芯片技术已用于肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和肾癌等多种常见恶性肿瘤的相关分子标志物的研究,并获得一些具有临床重要应用价值的分子标志物。2.1her-2/neu与nsclc的临床信息背景,主要有基因芯片和菌株Tan等利用高密度TMA、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和荧光标记的原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术在同一实验条件下检测了表皮生长因子家族的第2位成员HER-2/neu(也称C-erbB-2)在140例非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中的表达,检测有效率达到了94%,且与传统的整个病理组织切片方法相比较,实验结果相差无几。研究结果显示HER-2/neu蛋白的过表达与HER-2/neu基因扩增显著相关,且HER-2/neu基因扩增及其蛋白强阳性表达的患者具有较短的生存期,低分化和高分化肿瘤组织中HER-2/neu表达和基因扩增率的不同,表明HER-2/neu与NSCLC的发生、发展和预后有关。Sugita等结合TMA和基因芯片技术快速筛选和鉴别了与临床相关的肺癌生物学标记,首先用基因芯片检测了两种NSCLC细胞系(A549,H647)和两种小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)细胞系(SHP-77,UMC-19)的基因表达谱,然后在含187个NSCLC组织标本的芯片上进行免疫组化染色。结果显示在20种异常高表达的基因中有6种属于癌/睾丸抗原(cancer/testisantigen,CTAG)基因家族,包括NY-ESO-1和5种MAGE-A亚家族基因,它们在SCLC细胞系中均高表达,而在NSCLC细胞系中NY-ESO-1不表达,MAGE-A低表达;另经免疫组化证实,44%的早期NSCLC细胞胞浆和/或核中表达MAGE-A,认为MAGE-A基因表达与NSCLC(尤其是鳞状细胞癌)的组织学分型有关,CTAG基因及产物的表达对早期鳞状癌和小细胞癌的检测和病情监测有重要作用。可见基因芯片与TMA配合使用能够快速地筛选肿瘤相关基因并评估其生物学意义,有助于建立与诊断、治疗和预后有关的指标,构成完整的基因检测体系。Tan等利用TMA与免疫组化研究了甲状腺转录因子-1(TTF-1)在NSCLCs中的表达及临床意义,结果显示TTF-1在肺腺癌中显著表达,有可能作为NSCLCs的一种预后因素。Deeb等利用Beecher组织微阵列仪从130例肺癌组织(Ι~ША期)石蜡标本中每例凿取2~3个组织柱制备了组织微阵列,研究发现E-cad和EGFR的表达情况可作为肺腺癌和肺鳞癌临床分期的根据,E-cad阴性和E-cad在细胞质中的异位表达与低生存率显著相关,EGFR的表达与生存率无关。2.2肺癌肿瘤相关基因表达抑癌基因表达下调或缺失与多种恶性肿瘤密切相关。Lo等利用RT-PCR和组织芯片免疫组化染色法研究Ras相关结构域家族基因1A(Rasassociationdomainfamilygene1A,RASSF1A)在鼻咽癌发病中的作用,发现鼻咽癌中RASSF1A在基因转录和蛋白表达方面均下调,并与WHO肿瘤分期、淋巴结转移等显著相关,表明RASSF1A可能作为鼻咽癌的分子标志。87%鼻咽癌临床标本中存在TSLC1基因表达下调或缺失。Lung等应用组织芯片和免疫组化法检测肺癌肿瘤抑制物1(tumorsuppressorinlungcancer1,TSLC1)的表达,发现与原发鼻咽癌比较,TSLC1在淋巴结转移的鼻咽癌中表达显著下调或缺失,提示TSLC1很可能是鼻咽癌淋巴结转移相关的肿瘤抑制基因。p63是新近被证实的p53家族的成员之一,Guo等构建了包含202例鼻咽癌、29例鼻咽部炎症病例以及17例正常鼻咽上皮的组织芯片,结合免疫组化法研究p63与鼻咽癌的关系,结果显示p63在鼻咽癌中高表达(100%,202/202),而在鼻咽部炎症和正常鼻咽上皮中不表达,p63可作为鼻咽癌诊断的辅助分子标志。Fan等制作了由148例鼻咽癌和164例具有不同病理形态学特征的非癌性鼻咽上皮组成的含390个组织点阵的鼻咽癌组织芯片,研究EB病毒编码的小RNA-1(EBER-1)和一些肿瘤相关基因在组织芯片中的表达,结果表明EB病毒感染、p53过表达以及p16和p27蛋白的表达缺失在鼻咽上皮癌变中起重要作用。KIAA1173基因位于染色体3p22.1区,是一个新发现的肿瘤相关基因,Zhang等采用组织芯片和原位杂交法证实KIAA1173基因高表达于正常鼻咽黏膜而在鼻咽癌中表达下调,认为KIAA1173很可能是与鼻咽癌癌变相关的新基因。2.3slp-2细胞信号转导Barlund等将比较基因组杂交(CGH)、cDNA芯片和组织芯片技术相结合研究乳腺癌基因扩增,发现17q23上至少有2个独立区域(S6K和HER-2)呈现高水平扩增;同时用668例原发性乳腺癌组织芯片进一步证实了在细胞系中的过表达和扩增基因的存在,且其扩增与预后差有关;S6K与HER-2同时扩增与生存期短相关。细胞质膜微囊蛋白-1(caveolin-1)在细胞信号转导中起重要作用,研究表明细胞质膜微囊蛋白-1与多种癌症发生发展的特定阶段密切相关。Liedtke等研究了正常、良性及恶性乳腺组织标本中细胞质膜微囊蛋白-1的表达情况,发现细胞质膜微囊蛋白-1与乳腺癌的浸润显著相关。已经证实SLP-2是一新的肿瘤相关基因,其蛋白在多种癌症中呈现高水平表达。Cao等应用乳腺癌组织芯片研究发现SLP-2高表达患者的生存率低,肿瘤体积较大,其淋巴结转移或远处转移的发生率也较SLP-2低表达者高。2.4波形蛋白的基因组化和病理组织学检测Richter等用FISH分析cyclinE基因在膀胱癌组织中的扩增情况,发现其扩增与膀胱癌分级、分期和预后显著相关。Moch等应用两种芯片技术研究肾癌细胞系CRL-1933的基因表达状况。第一步先采用含5148个cDNA克隆的DNA芯片研究肾癌细胞系与正常肾组织之间基因表达的差异,筛选出89个差异表达的基因,发现其中一个编码波形蛋白的基因差异最为显著;第二步用波形蛋白单抗作为探针,免疫组化方法检测由532个肾癌样本构成的组织芯片,发现波形蛋白常见于透明细胞癌和乳头状细胞癌,少见于嫌色细胞癌和大嗜酸性细胞癌,同时还发现波形蛋白与肾癌的预后不良相关,而与疾病分期和病理分化无关。Chen等利用组织芯片检测头颈癌中低氧调节蛋白的表达,发现细胞核因子κB(NF-κB)抑制物IκB激酶β是一种新型内源性肿瘤低氧性标记物,可能代表一种抗癌治疗的新靶标。2.5波形蛋白在肝脏肺癌转移中的表达Lugli等利用组织芯片分析肝细胞石蜡1(hepatocyteparaffin-1,HepParl)在正常肝脏组织和肿瘤组织中的表达,认为HepParl是鉴别原发性和继发性肝癌的标志。Hu等利用组织芯片技术发现波形蛋白(vimentin)的过表达与肝细胞肝癌的转移密切相关,表明波形蛋白过表达在肝细胞肝癌转移中起着重要的作用。Lee等应用TMA免疫组化方法分析线粒体丝氨酸蛋白激酶Omi/HtrA在60例晚期胃腺癌中的表达,结果发现阳性表达为43例(72%),而正常胃黏膜的黏液细胞和黏液颈细胞无表达或表达很弱,提示体内胃癌细胞凋亡需要有Omi/HtrA的表达。2.6埃兹蛋白和脑胶质瘤Tynnineu等应用组织芯片技术检测细胞骨架联接蛋白埃兹蛋白(ezrin)在299例原发性和复发性星形细胞瘤,以及113例少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤(均为WHOII~III级)中的表达,发现细胞埃兹蛋白染色的强度和数量与星形细胞瘤和少突星形细胞瘤的恶性程度增高有关,在星形细胞瘤中表达最强。同时发现,原发性胶质瘤中,埃兹蛋白的高表达与复发、预后差有关,并且在肿瘤进展期间也高表达。研究结果表明,埃兹蛋白表达与胶质瘤进展相关、组织学细胞类型和WHO肿瘤级别有关。此外,Schraml等构建17种恶性肿瘤的组织芯片,含397个肿瘤组织样本,用原位杂交分析发现,乳腺癌、肺癌、头颈部及膀胱来源肿瘤和黑色素瘤中有细胞周期素cyclinD1(CCND1)表达;在膀胱、乳腺、结肠、胃、睾丸和肺癌中有ERBB-2表达,ERBB-2是原癌基因ERBB-2编