低剂量x射线照射的小鼠胸腺细胞蛋白质表达及生物活性研究

低剂量x射线照射的小鼠胸腺细胞蛋白质表达及生物活性研究

根据该报告，低剂量辐射对生长发育、延长动植物的寿命、提高战斗力、降低剂量辐射对染色体的生成率进行了监测。但对这种反应的机制尚未完全阐明。Anderson等认为是由于低剂量辐射使细胞周期或细胞亚群发生了改变所致,但后来多数实验不支持这种假说;Ikushima等指出可能与DNA损伤后修复能力被低剂量辐射激活或者低剂量辐射激活某种调节系统,使细胞产生某种保护性物质而产生低剂量辐射兴奋效应。本文拟通过低剂量X射线照射小鼠诱导胸腺细胞蛋白质表达及其生物活性的观察,探讨低剂量辐射兴奋效应的可能机制。材料和方法1动物分组实验雄性健康昆明小白鼠,体重(20±2)g,购自吉林大学实验动物部。随机分为假照射组和75mGy照射组。照射后4h,断头处死,取胸腺制备单细胞悬液。2电压、电流2.2m用PhilipsX射线深部治疗机进行全身照射。电压200kV,电流10mA;过滤板0.5mmCu和1.0mmAl。靶皮距212cm,剂量率12.5mGy/min。3高效液相色谱仪美国产ECONOSystem低压层析仪,Spectra高效液相色谱分析仪,PAK300SW7.5mm(ID)×30cm色谱柱。1214-Rackbeta自动液闪计数仪(LKB,瑞典)。Olympus显微镜(日本)。4材料和试剂刀豆球蛋白A(concanavalin,ConA)购于Sigma公司,[3H]-TdR中国医学科学院原子能研究所产品,RPMI1640培养基(Gibco,美国),其它试剂均为国产分析纯。5细胞培养及提取分别断头处死75mGy照射和假照射4h的小鼠各100只,在无菌条件下取出胸腺(以下分离提取步骤均在4℃条件下进行),置于RPMI1640培养液中。毛玻璃片研磨制成单细胞悬液,经200目尼龙网过滤结缔组织。1000×g离心10min,弃上清,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次,将制得的照射组和假照射组单细胞悬液分别制备胸腺细胞蛋白质提取物。6洗脱和色谱测定将制得的胸腺细胞蛋白质提取物过0.45μm的硝酸纤维素滤膜后,分别取3mL加于1×50cm的SephadexG-100凝胶柱表面,用0.15mol/LPBS,以0.06mL/min的流速洗脱。在4℃的冰柜中,洗脱20h,每管收集120滴的洗脱物。取每管的洗脱物10μL注入HPLC色谱柱。在流动相为0.15mol/LPBS、流速1mL/min、柱压300psi、检测波长280nm的条件下,进行HPLC分析。7通过测定蛋白质活性并制备染色体样品采用本室的常规方法加以改进。8蛋白质测定和蛋白质分子量测定分别采用Lowry法和凝胶过滤法。结果1g-100凝胶过滤胸腺细胞粗提物经SephadexG-100凝胶过滤后,照射组和假照射组都出现两个峰,胸腺细胞第一峰两组无明显差别,第二峰照射组低于假照射组。2每管蛋白质组分将胸腺细胞的粗提物,经SephadexG-100凝胶过滤后,收集洗脱物得到12管蛋白质组分。每管蛋白质组分经过HPLC分析,发现只有第11管蛋白质组分照射组与假照射组比有明显差别,表现为胸腺细胞24.5kD的蛋白质照射组明显少于假照射组(图1)。图1第一峰照射组略高于假照射组,但是差别不显著(P>0.05)。3蛋白质组分对正常小鼠脾淋巴细胞转化的影响将胸腺细胞的粗提物,经G-100凝胶过滤后的第11管蛋白质组分加入ConA刺激的正常小鼠脾淋巴细胞转化的培养基中,结果发现终浓度为6.25mg/L的蛋白质组分照射组小鼠脾淋巴细胞转化明显低于假照射组(表1)。4染色体畸变试验从表2可以看出,将假照射组和照射组的胸腺细胞的粗提物第11管蛋白质组分(经G-100凝胶过滤后所得)预先加入接受1.5GyX射线照射的人外周血淋巴细胞中,发现照射组染色体畸变率明显低于假照射组。辐射诱导细胞的蛋白质表达低剂量辐射兴奋效应的机制,近几年受到人们的关注。有许多假说,其中低剂量辐射诱导细胞产生某种保护性物质是热点之一。Wolff等学者曾报道低剂量辐射可诱导人淋巴细胞合成蛋白质,并且该蛋白质能与DNA发生特异结合,此结合从照射后1h开始,6h达高峰。刘树铮等曾证明50mGy-75mGyX和γ射线离体和全身照射后淋巴细胞表达一些新蛋白质,其分子量由25-247kD不等。这些蛋白质还具有生物活性,可刺激T细胞的增殖或减轻辐射对染色体的损伤。本文进一步证明小鼠接受75mGy全身照射后4h,胸腺细胞内蛋白质发生了变化,从照射组小鼠胸腺细胞提取的蛋白质经SephadexG-100凝胶过滤后,第11管终浓度为6.25mg/L的蛋白质组分不仅具有抑制正常脾细胞增殖的作用(表1),而且能够降低较高剂量X射线所致人外周血淋巴细胞染色体畸变的作用(表2)。将这一管的蛋白质组分进行HPLC分析,发现分子量为24.5kD的蛋白质显著少于假照射组(图1)。提示这种蛋白质可能是刺激性蛋白质,由于这些蛋白质的表达下调而使ConA刺激的正常脾淋巴细胞转化下降。另一方面,24.5kD的蛋白质的减少,也可能激发染色体的防护机制和损伤修复程序,使较大剂量辐射所致染色体畸