新藤黄酸对人鼻咽癌细胞cne-1凋亡的影响

新藤黄酸对人鼻咽癌细胞cne-1凋亡的影响

新藤黄酸是对中药藤黄酸分离的有效结论。在我们的实验室早期，初步研究了新藤黄酸体内的外肿瘤活性。结果表明，新藤黄酸除了能够抑制肿瘤细胞的生长外，还包括人类的淋巴结细胞ht-29、人体内的肝癌细胞bel-7402、人体内的血液样本细胞k562以及人体内的其他癌细胞。而在鼻咽癌的研究中已有药物能诱导鼻咽癌细胞凋亡,例如高三尖杉酯碱和茶中多酚类物质EGCG等报道。但新藤黄酸对鼻咽癌细胞CNE-1的作用尚未见报道,因此本文进行了这方面研究。1材料和方法1.1pcr和p-3药物:新藤黄酸(纯度:≥99.0%;批号:20090314)为安徽中医学院自制;抗体β-actin、CytochromeC、p38、ERK1/2购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA,USA)公司;Caspase-3购自Bioworld(BioworldTechnology,MN,USA);p-p38、pERK1/2购自CellSignaling(CellSignalingTechnology,MA,USA)公司;Westernblot和其他试剂来自Abcam(Cambridge,MA,USA)或者Sigma-Aldrich(SaintLouis,MO,USA)公司。1.2细胞培养dmem鼻咽癌细胞CNE-1购自美国细胞菌种库(ATCC),细胞在体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。并于37℃,5%CO2条件下恒温恒湿培养箱中培养,选取对数生长期细胞进行实验。1.3贴壁培养选取CNE-1细胞对数生长期接种于6孔板,并贴壁培养过夜。各实验组按要求给予新藤黄酸不同浓度和时间的药液加药处理细胞,同时设control组,处理完后在倒置显微镜下观察并拍照。1.4dmso-mtt法检测细胞存活率CNE-1细胞用胰酶消化并稀释约为1×106·L-1的活细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔180μl,每组设6个复孔,贴壁过夜后加不同浓度的新藤黄酸药液20μl,使其终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0μmol·L-1,control组加入20μl完全培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养不同时间(24、48和72h),每孔加入5.0g·L-1的MTT20μl,继续孵育4h后,小心吸弃全部上清液,每孔加入150μlDMSO,振荡后,用酶标仪(570nm)记录各孔的吸光度(OD),细胞存活率/%=处理组OD/对照组(control)OD×100%,实验重复3次。1.5体外培养时间采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,取对数生长期的CNE-1细胞接种于6孔培养板,培养过夜后弃去原来培养基,加入2.0μmol·L-1新藤黄酸后继续培养,control组则换用完全培养基。作用不同时间后,用0.25%胰酶消化细胞(不含EDTA-Na),各组样本细胞数调整为1×106~5×106·L-1,2000r·min-1离心5min弃去培养液。PBS洗涤2次,2000r·min-1离心5min。加入400μl缓冲液重悬细胞。加入5μlAnnexinⅤ混匀后再加入5μlPI混匀。室温下避光孵育15min。1h内流式细胞仪检测。1.6黄酸处理培养细胞接种于6孔板,过夜贴壁培养后再加新藤黄酸处理24h,control组加完全培养基继续培养。胰酶消化后收集细胞,PBS洗两遍,用戊二醛固定,电镜观察并细胞摄片。1.7sds-/pas凝胶电泳CNE-1细胞在2.0μmol·L-1新藤黄酸不同时间作用后用细胞裂解液提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。10%~15%分离胶和5%浓缩胶进行SDS电泳,然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。再5%脱脂奶粉封闭,4℃一抗孵育过夜。PBST洗涤3次,每次10min。再加HRP标记的二抗稀释液温育2h,PBST洗涤3次,每次10min。用ECL进行显影,Bio-Rad凝胶成像系统采集图片。1.8统计分析及统计学处理实验数据以表示,采用Prism5.0software(GraphPadsoftware,SanDiego,USA)统计软件进行单因素方差分析及两个独立样本的t检验。2结果2.1固缩变圆形态观察在不同的浓度和不同时间经过新藤黄酸处理CNE-1细胞后进行显微镜观察,可以看出在不同浓度新藤黄酸作用于CNE-1细胞24h后,显微镜下观察发现部分细胞固缩变圆,体积变小,少量细胞贴壁不牢,呈半贴壁状态,尤其在高浓度(4.0、8.0μmol·L-1)CNE-1细胞多数固缩变圆,较多细胞脱落,漂浮于培养液中(Fig1A)。在2.0μmol·L-1新藤黄酸作用CNE-1细胞,随着时间的延长CNE-1细胞也出现细胞贴壁不牢,细胞数目减少,作用细胞48h后,细胞基本脱落,碎裂并漂浮于培养液中(Fig1B)。2.2新藤黄酸处理人案MTT法检测表明,在0.25~8.0μmol·L-1浓度范围内的新藤黄酸处理人鼻咽癌CNE-1细胞24、48和72h后,与control组比较,各给药组细胞存活率降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义(Fig2)。2.3新藤黄酸检测细胞损伤作用2.0μmol·L-1新藤黄酸作用24h后可见大约50%的CNE-1细胞发生凋亡,并且随着作用时间增加细胞凋亡率也随之上升(Fig3)。该作用通过透射电子显微镜得到了进一步的证实,电镜下细胞出现胞体皱缩变圆、胞质凝缩,细胞质失水浓缩,细胞核发生典型核染色质固缩、核碎裂成碎片等现象(Fig4B),其中可以观察到与control组相比新藤黄酸对线粒体的损伤,包括线粒体膜的破裂、肿胀(Fig4D),而正常线粒体形态正常,嵴清晰完整,排列整齐(Fig4C)。这些结果显示,新藤黄酸能诱导CNE-1细胞凋亡。2.4新藤黄酸诱导cne-1细胞凋亡的分子机制检测在新藤黄酸2.0μmol·L-1不同时间作用下CNE-1细胞内CytochromeC和Caspase-3蛋白随着时间的增加蛋白表达量呈现时间依赖的增加(Fig5),为进一步探究新藤黄酸诱导CNE-1细胞凋亡的分子机制,还检测了细胞内p38、ERK1/2、p-p38、p-ERK1/2的蛋白表达情况,该结果表明在2.0μmol·L-1新藤黄酸处理后p-p38在短时间内被激活(Fig6A),pERK1/2蛋白表达则呈现时间依赖性的减少(Fig6),而蛋白p38和ERK1/2的表达水平基本不变(Fig6B)。3新藤黄酸诱导cne-1细胞凋亡鼻咽癌的高发地区包括东南亚,还有北极地区的原住民,以及北非阿拉伯人和中东部分地区,尤其是在中国的广东省的中部。而且儿童和成人鼻咽癌5年的存活率大约60%。目前,鼻咽癌的治疗主要是依靠化学疗法和放射疗法或者两者相结合,新藤黄酸作为一种天然的植物提取物,具有前景的抗肿瘤药物,并具有抗癌谱广、毒性低特点,前期实验也表明新藤黄酸可以抑制结肠癌、肝癌、胃癌、非小细胞肺癌和卵巢癌细胞增殖,已经越来越引起人们的关注。本实验研究发现新藤黄酸在不时间和浓度下能抑制CNE-1细胞的增殖,诱导细胞凋亡。其凋亡机制可能与线粒体凋亡途径相关,通过电镜可以观察细胞内线粒体形态发生变化,并出现了线粒体膜通透性改变,线粒体膜受损。而且Westernblot实验也检测到CytochromeC和Caspase-3随着时间的延长蛋白表达量依赖性的增加。也有其他文献报道诱导鼻咽癌细胞凋亡通过线粒体信号途径,这与本实验结果相类似。MAPK家族在鼻咽癌抗肿瘤活性中起着重要的作用,越来越多的报道表明MAPK家族成员在鼻咽癌的研究中具有重要的生物活性。p-ERK1/2和p-p38MAPK是MAPK信号传导通路中是重要的调控蛋白,对调控细胞增殖和细胞凋亡具有极其重要的作用。实验结果表明:新藤黄酸处理CNE-1细胞后,p38、ERK1/2蛋白基本没有变化,pp38在短时间内被激活,p-ERK1/2则呈现时间依赖性的表达减少。这些蛋白的