薏苡仁脂肪酸类成分对smmc-7721细胞增殖抑制作用机制初探

薏苡仁脂肪酸类成分对smmc-7721细胞增殖抑制作用机制初探

爱斯隆是水稻科的一种干燥、成熟的植物，具有水果甜、淡、甜的特点。可归经脾、胃、肺经络。具有补水、健脾、止泻、除瘀、解毒、散泻的功效，用于水肿、气滞、排尿、脾虚腹泻、湿热、收缩、肺蠕虫、肠蠕虫和癌肿。薏苡仁中含有多种活性成分,主要包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡内酯、糖类、甾醇类、三萜类等化合物［2-5］。根据文献调研结果,发现薏苡仁脂肪酸类成分的抗肿瘤活性报道较多,但其抗肝脏等恶性肿瘤作用机制研究较少。本实验是在前期薏苡仁脂肪酸类成分富集、解析研究工作基础上［6-7］,即药效物质成分构成基本明确的基础上,采用MTT法对薏苡仁脂肪酸类成分进行体外抗肝脏肿瘤实验,发现富集到的薏苡仁脂肪酸类成分具有明显的抑制肿瘤活性。在此研究基础上,进一步采用流式细胞仪PI染色法和AnnexinV-EGFP/PI双染法研究薏苡仁脂肪酸类成分对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨其对SMMC-7721肿瘤细胞的作用机制,为今后开展治疗原发性肝癌创新药物的研究开发奠定基础。1血清dmem培养液和仪器1.1细胞株人肝癌SMMC-7721细胞(上海复蒙生物有限公司,培养于含胎牛血清的DMEM培养液中)。1.3主要仪器流式细胞仪(美国BD公司);CO2培养箱(德国NuAire公司);酶标仪(瑞士Tecan公司);电子天平(德国赛多利斯集团);倒置相差显微镜(德国麦克奥迪公司)。2样品的制备与检测2.1薏苡仁脂肪酸类成分体外药效学检测［8-9］2.1.1细胞培养人肝癌SMMC-7721细胞复苏后,按贴壁细胞培养法,以细胞计数5×105个/mL培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中,每两天传代一次,取对数生长期细胞进行实验,培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。2.1.3统计学分析采用SPSS16.0软件单因素方差分析进行多组间比较,结果用ue0af±s表示,P<0.05为有显著性差异,同时计算IC50值。2.2薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞株细胞周期的影响2.2.1药物制备与分组精密量取薏苡仁脂肪酸类成分1mL,加0.5%CMC-Na5μL,用培养液配制成质量浓度为62.5μL/mL的贮备液作为高剂量组;再按比例稀释成质量浓度为15.63μL/mL的溶液作为低剂量组,0.22μm微孔滤膜过滤,备用。2.2.2细胞周期的检测(碘化丙啶PI单染法)取对数生长期细胞,常规培养至细胞计数为1×107个/瓶,分别加入62.5μL/mL,15.63μL/mL薏苡仁药液,空白对照组加入含0.5%CMC-Na的等体积培养液,36h后收集细胞。用冷PBS液洗涤细胞2次后,加入预冷的70%乙醇4℃下固定12h,再用PBS液洗涤细胞1次。每组细胞样品中加入0.5mLPI染色液,混悬,37℃避光温浴30min,流式细胞仪488nm处检测,ModFit细胞周期拟和软件分析［8-9，13-15］。2.3薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞株细胞凋亡的影响2.3.1药物制备与分组精密量取薏苡仁脂肪酸类成分1mL,加0.5%CMC-Na5μL,用培养液配制成质量浓度为31.25μL/mL的贮备液作为高剂量组;再按比例稀释成质量浓度为15.63、7.81μL/mL的溶液作为中、低剂量组,0.22μm微孔滤膜过滤,备用。2.3.2细胞凋亡的检测(AnnexinⅤ-EGFP/PI双染色法)取对数生长期细胞接种于6孔板中,细胞计数为1×105个/孔,24h后,每孔加入1mL不同组别药物,对照组1加入等体积培养液,对照组2加入等体积0.5%DMSO水溶液,分别培养22、46h后,收集细胞,用冷PBS洗涤细胞2次后,加入BindingBuffer500μL,悬浮细胞,然后再分别加入5μL的AnnexinV-EGFP和PropidiumIodide,混匀,室温避光反应5~15min,在1h内,用流式细胞仪CellQuest软件分析细胞凋亡情况［8-9，16-18］。2.4统计学分析采用SPSS16.0软件进行t检验分析,结果用ue0af±s表示;P<0.05,0.01,0.001表示差异有统计学意义。3不同给药时间及给药剂量对smmc-7721细胞系3.1薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞株的增殖抑制作用6.25~200μL/mL薏苡仁脂肪酸类成分,作用SMMC-7721细胞24、48、72h后,对细胞的增殖抑制作用结果见表1。由表1可知,薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞抑制作用显著,随着药物质量浓度与作用时间的增加与延长,细胞抑制率逐渐增加,表现出了较好的剂量-效应关系,不同给药时间下均在给药剂量为100μL/mL时效果最好。从给药时间上看,给药72h各组表现出较好的抑制率,IC50随时间的延长逐渐降低,说明薏苡仁脂肪酸类成分体外起效具有一定的时间-效应关系。3.2薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞株细胞周期的影响由表2、图1可知,在G0/G1期,给药组与空白组比较DNA水平均有所增加,高、低剂量组较空白组均有显著性差异(P<0.01);S期,给药组与空白组比较,含有量差异不大;G2/M期,给药组与空白组比较DNA水平明显降低,高、低剂量组较空白组均有显著性差异(P<0.001)。说明薏苡仁提取物能造成SMMC-7721细胞G2/M期阻滞,从而影响细胞周期正常进行。3.3薏苡仁脂肪酸类成分对SMMC-7721细胞株细胞凋亡的影响由图2、表3可知,当药物作用细胞22、46h后,3个给药组与对照组比较,早期凋亡比例与凋亡总比例均有显著差异;另外,药物作用46h后的细胞,晚期凋亡比例也出现了显著差异。随着药物浓度与作用时间的增高和延长,细胞凋亡率也随之增大。表明薏苡仁脂肪酸类成分促进SMMC-772l细胞凋亡作用明显,尤其是作用22h后的早期凋亡,说明薏苡仁脂肪酸诱导细胞凋亡主要作用在早期。4主要成分对人肺癌smmc-9721细胞凋亡的抑制作用肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。全球发病率逐年增长,已超过62.6万/年,据统计,每年因肝癌死亡人数接近60万人,居于恶性肿瘤的第五位。目前我国发病人数约占全球的半数以上,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手［19-20］。本实验前期对薏苡仁脂肪酸类成分开展了分离富集、成分分析研究,得到的薏苡仁脂肪酸类成分主要由三亚油酸甘油酯、二亚油酸甘油酯、棕榈酸二亚油酸甘油酯、亚油酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸油酸甘油酯、二棕榈酸亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕榈酸二油酸甘油酯、二棕榈酸油酸甘油酯、二油酸硬脂酸甘油酯等成分组成［6］。本研究发现,该成分对人肝癌SMMC-7721细胞株具有明显的增殖抑制作用。进一步的细胞周期与细胞凋亡实验表明,薏苡仁脂肪酸类成分可诱导SMMC-7721细胞凋亡,且随着作用时间的延长,晚期凋亡比例逐渐上升,这种诱导效应呈现出明显的时间-剂量-效应关系。薏苡仁脂肪酸类成分对细胞周期的作用是通过抑制G2/M细胞周期实现的。本实验研究说明薏苡仁脂肪酸类组分对人肝癌SMMC-7721细胞的作用机制是通过诱导SMMC-7721细胞早期凋亡,抑制G2/M细胞周期,从而达到治疗肝肿瘤的作用,该研究为研制抗肝癌现代新药提供方向。1.2主要药材薏苡仁脂肪酸类成分(辽宁中医药大学分析测试中心自制);环磷酰胺片(CTX)(南通精华制药有限公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司);AnnexinV/PI双染色试剂盒(南京凯基生物技术有限公司);DMEM培养基与胰蛋白酶(美国Gibco公司);超纯水(由Milli-Q纯水系统制得)。2.1.2细胞增殖抑制实验(MTT法)取对数