乳及乳制品微生物检验食品中大肠菌群检测

乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测YLNB3.21、引用依照：GB/T4789.3-20232、术语和定义大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要根源于人畜粪便，故以此作为粪便污介入标来谈论食品的卫生质量，推想食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以 100ml(g)检样内大肠菌群最可能数〔MPN〕表示。3、仪器及器械3.1恒温培育箱：36±1℃；3.2冰箱：0-4℃；3.3恒温水浴锅：46±1℃；3.4天平；3.5显微镜；3.6均质器或乳钵；3.7灭菌平皿：直径 90mm；3.8灭菌试管：18×18020×200；3.9灭菌吸管：1ml10ml；3.10灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml；3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm；1/11载玻片；酒精灯；试管架；灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。4、培育基和试剂乳糖胆盐发酵管；伊红美兰琼脂平板；乳糖发酵管；生理盐水；革兰氏染色液。5、检验程序不产气

大肠菌群检验程序稀释乳糖胆盐发酵管36±1℃，24±2h

:检样产气大肠菌群阴性 伊红美兰琼脂平板36±1℃，18~24h报告2/113/11革兰氏染色革兰氏阳性

乳糖发酵 36±1℃，24±2h管大肠菌群阴性

革兰氏阴性无芽孢杆菌 大肠菌群阳性

不产气大肠菌群阴性6、方法检样稀释以无菌操作将检样25ml〔或g〕放于装有 225ml灭菌生理盐水或其余稀释液的灭菌玻璃瓶内〔瓶内预置适宜数目的玻璃珠〕或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10的平均稀释液。固体检样最好用均质器， 以8000～10000r/min的速度办理 1min，做成1：10的平均稀释液。用1ml灭菌吸管吸取 1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其余稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100

的稀释液。另取1ml 灭菌吸管，按上条操作挨次做释液，每递加稀释一次，换用一支

10依据食品卫生标准要求或对检样污染状况的估量，选

1ml

灭菌吸管。择三个稀释度，每个稀释度接种 3管。乳糖发酵试验：〔寻常所说的假定试验：其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌〕将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内， 接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种 3管，置36±1℃培育箱内，培24±2h，如全部乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，假设有产气者，则按以下程序进展。分别培育：〔目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反响的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在〕将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置 36±1℃培育箱内，培育 18～24h，而后拿出，观看菌落形态，并做革兰氏染色和证明试验。证明试验〔复发酵试验〕:( 目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反响的试管内分别到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体 )在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1～2个进展革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 36±1℃培育箱内，培育242h，观看产气状况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。报告MPN100ml〔g〕大肠菌群的最可能数〔1〕。7、留意事项初发酵和证明试验乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性其实不代表大肠菌群阳性，所以，确定作进一步证明试验。产肚量与倒管试验表示，大肠菌群的产肚量与大肠菌群的检出率呈正相关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产肚量多者可布满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。假设对产酸但未产气的乳糖发酵管假设有疑问，可用手轻轻感人试管,假设有气泡沿管壁上调，即应试虑可能有气体产生，而应作进一步试验。别的，产肚量与倒气管有必定的关系，倒气管口不完好，有益于气体的进入；管口四周有积淀等物质能影响气体的进入。优选菌落在平板表达紫黑色，有或无金属荣耀，检出率最高；粉红色、粉色检出率最低。别的，只优选一个菌落影响大肠菌2～3抑菌剂大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要作用是抑制其余杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有偏差，即可对抑菌作用产生影响，所以抑菌剂的增加应严格依照标准方法增加。指示剂pH5.2～6.8〔pH=7.4±0.1〕的颜色由紫色变成黄色时，证明培育基中有酸性物质产生，此时培育基的PH≤5.2，培育基呈酸性。7.6MPNMPN为最大可能数的简称， 表示样品中活菌的密度，是用概率论来计算样品中菌数近来似的数值。MPN检索表只给出了三个稀释度，假设改用不一样的稀释度，则表内数值应相应降低或增加 10倍。用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡，有气泡时就不行以使用，接种以后，要用同批未接种的发酵管置于温箱内，同时培育，作为空白。检查初发酵试验的乳糖胆盐管内能否有乳糖分解菌存在时，应以产气为主，产酸仅作参照。由于培育基中所用的指示剂为溴甲酚紫， 其有效PH为 ，变色点为6.0，假设产酸未能到达使降落至 6.0以下时，变色就不明显。检查发酵管中小导管内气泡时，即便只有微量气泡出现，亦应推断为阳性。有时小导管的管口被样品颗粒封住，气体未能进入导管，如加以振摇，管低有吝啬泡上涨，亦应视为阳性。大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰联合而成黑色物，故菌落呈紫黑色〔大肠杆菌〕或褐色〔产气克雷伯氏菌等〕，前者有时还产生有金属荣耀。表1大肠菌群最可能数〔 MPN〕检索表阳性管数MPN阳性管数MPN110-110-2100ml(g110-110-2100ml(g000)＜30200)90001302011408/1111/110026020220000390203260010302101500116021120001290212270013120213340020602202100219022128002212022235002316022342003090230290031130231360032160232440033190233530100403002301017030139010211030264010315030395011070310430111110311750112150312120011319031316001201103209301211503211500122200322210012324032329001301603302400131200331460013224033211000133290333≥24000注：①本表承受g(mL)】、每个稀释度接种

30.1g(mL)3

、0.01g(mL)、0.001g(mL)时，表内数字相应降低g(mL)、0.0001g(mL)

1g(mL)、0.1g(mL)、0.01100.01g(mL)、0.001类推。

时，表内数字相应增加内容总结

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