菜花DNA的粗提取与鉴定

菜花DNA的粗提取与鉴定1.实验原理（1）DNA与杂质的溶解度不同，在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。（2）在提取液中加入冷却的95%酒精溶液中，能析出DNA，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。2.实验步骤（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。例如，菜花细胞的染色体数是2n=18，香蕉细胞的染色体数是3n＝33，染色体数还算比较多。（2）破碎细胞：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。植物细胞需要研磨液在研钵中充分研磨。研磨液中的十二烷基硫酸钠（SDS），有利于核蛋白变性并与DNA分离，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。（3）去除滤液中的杂质：利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，控制NaCl溶液的浓度去除杂质。（4）DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。（5）DNA的鉴定：取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。3.实验成功的关键（1）材料的选择：本实验选用菜花，是因为菜花细胞无色，容易观察颜色变化。取表层花的部分进行研磨是因为这个部位细胞处于迅速分裂状态，DNA含量高。（2）研磨充分与否：如果研磨不充分，细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量偏少，会导致看不到絮状沉淀物或沉淀物量少、用鉴定试剂鉴定不显示蓝色等。研磨充分，DNA释放的量更多，提取和鉴定的效果则更加明显。（3）研磨仪器的选择：相较于传统的研磨工具研钵，研磨过滤器具有研磨更快速、充分、安全、节约试剂等优势，提取和分离一“器”呵成。（4）移液动作轻柔：提取过程中，加入冷的95%乙醇后，需倾斜试管，吸头接触试管内壁，让溶液贴着管壁缓慢流下，切忌快速加入冲散已析出的DNA絮状物。旋转试管动作快速轻柔，并始终沿着一个方向，使得絮状物析出并凝结成团，切忌剧烈振荡，以免破坏絮状物。（5）试剂品质与配制规范：DNA鉴定试剂是本实验成功的关键试剂，不仅要严格遵循A、B液的配比，更要遵循“现配现用”的基本原则，以保证最佳的实验效果。

典型试题解析

试题1：在利用菜花进行“DNA粗提取与鉴定”实验中，相关操作正确的是（）A.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝B.向菜花研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA酶活性C.向质量浓度为2mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应缓慢加入，直到出现黏稠物为止D.向溶有粗提物的NaCl溶液中加入冷却的体积分数95%的酒精，可获得较纯净的DNA解析：首先将DNA丝状物溶解在一定浓度的氯化钠溶液中，再滴加二苯胺试剂和水浴加热，A错误；向菜花研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA的溶解度，不会降低DNA酶的活性，B错误；向质量浓度为2mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应缓慢加入，直到出现的黏稠物不再增加为止，C错误；DNA不溶于酒精，因此向溶有粗提物的NaCl溶液中加入冷却的体积分数95%的酒精，可获得较纯净的DNA，D正确。故答案为D。试题2：某同学以菜花为实验材料，进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，步骤如下：步骤一：称取30g菜花，去梗取花，切碎。步骤二：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。步骤三：在漏斗中垫上滤纸，将菜花研磨液过滤到烧杯中。在冰箱中放置几分钟，取上清液。步骤四：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的某溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液。将絮状物缠绕在玻璃棒上。请回答下列问题：（1）请指出并改正该同学实验操作中的错误：

。（2）步骤二的目的是使菜花细胞破碎，释放DNA，加入研磨液的主要成分有

和

等。（3）如要使步骤三所得上清液中杂质减少，可进行

操作后再置于冰箱。（4）步骤四中所用两倍体积的某溶液为

，需“缓缓、轻轻地”搅拌溶液的原因是

。（5）简要说明鉴定步骤四所得絮状物是DNA的基本实验设计思路：

。答案：（1）滤纸应改为纱布（或尼龙布）（2）洗涤剂NaCl

（3）离心（4）体积分数为95%的冷酒精防止DNA断裂（5）将絮状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热，观察颜色变化，同时用相应浓度的NaCl做对照实验。

DNA的粗提取与鉴定1．提取原理DNA与杂质的溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的耐受性不同。NaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液溶解规律DNA溶解析出蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大2.实验设计(1)材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血、菜花、洋葱等。(2)破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用纱布过滤，收集滤液。(3)去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。(4)DNA析出：将处理后的溶液过滤，加人与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为95%)。3．DNA的鉴定DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min，溶液变成蓝色。4．操作过程①实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大，如鸡血、菜花、洋葱等。②破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，用纱布过滤后收集滤液即可。如果是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液③去除滤液中的杂质方案1：利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。通过调节NaCl溶液的浓度出去溶于和不溶于NaCl溶液的杂质。方案2：利用DNA对酶的耐受性。直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，而不会破坏DNA。方案3：利用DNA对高温的耐受性。注意严格控制温度范围，使蛋白质变性沉淀而DNA分子还未变性，这样可将DNA与蛋白质分离。④DNA的析出和鉴定DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液(体积分数95%)，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。DNA的鉴定：取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。DNA的粗提取与鉴定实验是高考大纲中考点之一，但没有出现在必修和选修三中，非常容易被忽略，把考试要点列出来，赶紧学习一下。提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1.DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3.DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。4.实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。5.破碎细胞，获取含DNA的滤液在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。6.去除滤液中的杂质方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。特别提醒：①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。②方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。7.DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。8.以血液为实验材料时每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。9.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。10.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高，实验选用2mol/lNaCl和0.015mol/lNaCl做溶解试剂。

5.1DNA的粗提取与鉴定基础知识填空与背记一、DNA的提取思路提取生物大分子的基本思路是选用一定的

物理或化学

方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与

RNA

、

蛋白质

和

脂质

等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

二、DNA的理化性质1.DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的

NaCl溶液

中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使_杂质_沉淀，或者相反，以达到分离目的。随着NaCl溶液浓度的增大，DNA的溶解度_先减小后增大_。在__0.14mol/L_浓度下，DNA的溶解度最小，要使DNA充分溶解，一般采用_2mol/L_浓度的NaCl溶液。此外，DNA不溶于

酒精

溶液，但是细胞中的某些

蛋白质

则溶于

酒精

溶液。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：

蛋白酶

能水解蛋白质，但是对

DNA

没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在

80℃

以上才会变性。洗涤剂能够瓦解

细胞膜，但对

DNA

没有影响。3.DNA的鉴定：在

沸水浴

条件下，DNA遇

二苯胺

会被染成蓝

色，因此

二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

三、实验设计1.实验材料的选取：凡是含有

DNA

的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量较高

的生物组织，成功的可能性更大。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？哺乳动物的红细胞、在液体培养基的大肠杆菌。(材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌)2.破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的

蒸馏水

，同时用玻璃棒

搅拌，过滤后收集滤液即可。提取花椰菜的DNA时，在捣碎的花椰菜中加入一定的

洗涤剂

和食盐

，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。教材问题

①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。

②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的DNA滤液中可能含有哪些细胞成分？

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质3.去除滤液中的杂质：★方案一：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中

溶解度

不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质

。具体做法是：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液物质的量浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液物质的量浓度为0.14mol/L,析出DNA，过滤

去除溶液中的杂质，再用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解

DNA

。方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应

10-15

min，嫩肉粉中的

木瓜蛋白酶

能够分解蛋白质。方案三：将滤液放在60-75℃的恒温水浴箱中保温10-15min，注意严格控制温度范围。目的是除去担蛋白质等杂质。教材问题