大蒜根系分泌物的化感作用及化感物质研究

大蒜根系分泌物的化感作用及化感物质研究

化感效果指植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物的不利或不利作用。其中植物或微生物代谢产生的化学物质称为化感物质。化感物质的释放途径主要有淋溶、挥发、根系分泌、残株降解、花粉传播和种子萌发等。目前对大蒜根系分泌物的化感作用研究主要在化感效应上,而对化感物质的分离及成分分析尚未见报道。为此,本试验采用琼脂培和砂培2种栽培方式收集大蒜根系分泌物,利用极性不同的有机溶剂对大蒜根系分泌物进行萃取,并对各有机溶液萃取液进行生物活性测定,选取活性最强的组分,利用GC-MS分析,寻找主要的化感物质,以便为大蒜化感作用的进一步研究和应用奠定理论基础。1材料和方法1.1材料表面供体材料为蔡家坡紫蒜,受体作物为萝卜(大连小五英水萝卜),种子均购于陕西杨凌西北农林科技大学农科城种业科技中心。1.2方法1.2.1大蒜根系混合物砂培的制备固体琼脂培的具体做法是:首先挑选质量一致的蒜瓣,在无菌条件下将蒜瓣先用200mL体积分数75%乙醇表面消毒1min,无菌水冲洗3~5次,再用100g/L次氯酸钠溶液消毒30min,无菌水冲洗3~5次后,播入装有50mL琼脂培养基(6%)的塑料瓶中,每瓶5瓣,40d后拔出大蒜,称根质量后,按照每g根5mL蒸馏水的比例加入蒸馏水浸提琼脂,过滤后收集滤液即为大蒜根系分泌物。砂培的具体做法是:先取颗粒大小相近的石英砂,经2mol/LHCl浸泡48h后,用自来水冲洗至中性,再用蒸馏水淘洗数次。将质量一致的蒜瓣播在石英砂上,生长40d后拔出大蒜,并称根质量,按与固体琼脂培相同的比例加入蒸馏水洗砂,过滤后收集滤液即为大蒜根系分泌物。1.2.2有机溶剂萃取采用萃取的方法对大蒜根系分泌物化感物质进行分离。各取2种方法收集的大蒜根系分泌物500mL,质量浓度为0.2g/mL,分别用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇4种有机溶剂与大蒜根系分泌物按2∶1体积比进行萃取,萃取3次后,将上述8份有机溶剂萃取液经无水硫酸钠干燥,减压浓缩至干,溶于5mL甲醇中,放入-20℃冰箱,留待生物检测。琼脂培各有机溶剂萃取液依次简称为A1、A2、A3、A4,砂培各有机溶剂萃取液依次简称为B1、B2、B3、B4。1.2.3种子萌发率的测定准确吸取各组分的甲醇溶液2mL,加入底部铺有滤纸的培养皿中,待甲醇完全挥发后加9mL蒸馏水,在滤纸上均匀地摆放100粒萝卜种子,25℃、4000lx条件下发芽,6d后统计发芽率,10d后统计根部的长度。对照中先加入2mL甲醇,挥发后再加蒸馏水。3次重复。1.2.4分析测试方法根据生物检测的结果,选取2种栽培方式中化感优势组分中的强活性组分,采用GC-MS(美国安捷伦)分析鉴定生物活性强组分物质。气相色谱仪为Agilent6890N,质量选择检测器为AgilentTechnologies5973,分析软件AgilentChemistation,色谱柱:30m×0.25mm×0.25μm,HP-5MS毛细管柱。柱箱升温程序:90℃(1min),以10℃/min(He)升温。进样量1μL。离子源EI,电子源温度230℃,电极电压1000V,四极杆温度150℃,全扫描范围30~600m/Z。经计算机数据系统检索并参照有关质谱文献进行人工检索,综合分析鉴定结构,峰面积归一法计算各化合物的相对含量,分析鉴定其中生物活性强的物质。2结果与分析2.1不同有机溶剂萃取液萃取效果的比较用4种极性不同的有机溶剂对2种栽培方式的大蒜根系分泌物进行萃取,得到8个组分,这8个组分对萝卜种子的发芽率和根长的影响见图1和图2。从图1可以看出,A2和B2组分对萝卜的发芽率影响较大,均极显著低于对照。从图2可以看出,A2和B2组分对萝卜根长的影响也较大,均显著低于对照。8个组分对萝卜种子发芽率和根长的影响结果表明,4种有机溶剂萃取液的化感作用从强到弱依次为乙酸乙酯萃取液>三氯甲烷萃取液>正丁醇和乙醚萃取液,进一步表明大蒜根系分泌物中的化感物质主要集中在乙酸乙酯组分中。因此,需进一步对乙酸乙酯组分中的成分进行鉴定。2.2大根分泌物化感物质的测定2.2.1质谱扫描及各组分相对含量的分析采用琼脂培方法收集无菌条件下的大蒜根系分泌物,用不同极性的有机溶剂萃取,然后利用GC-MS对强化感作用的乙酸乙酯萃取液进行质谱扫描,图谱见图3,各成分相对含量见表1。由图3可知,出峰时间在30min后的物质多为烃类,对于烃类的化感作用报道较少,因此,本试验中不对烃类进行统计分析。由表1可知,琼脂培大蒜根系分泌物乙酸乙酯组分中除烃类外的物质成分,按照相对含量由高到低依次为2,6-二异丙基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚、叔十六烷基硫醇以及二烯丙基二硫醚。2.2.2各成分的测定3种栽培方式收集大蒜根系混合物的化感物质有研究表明,土壤因子以及土壤微生物对化感作用的影响非常大,如苜蓿在紧密性土壤中能表现出强烈的化感作用,但是在松散的土壤中则显示弱的化感作用;常见的酚酸类化感物质在砂质土、黏质土和粉砂壤土等各类结构的土壤中表现出不同的化感强度;由于土壤微生物的降解功能,使得在土壤中可逆吸附的酚酸类化感物质,如阿魏酸和香豆酸等在土壤中不能累积到有效浓度。本试验采用琼脂培的目的,是为了排除土壤和微生物对化感物质的影响,然后用砂培收集的根系分泌物与琼脂培进行比较,对大蒜根系分泌物中的化感物质进行初步确定,结果表明,2种栽培方式收集的大蒜根系分泌物的乙酸乙酯组分中的成分相似,只是在含量上差异较大。在这2种栽培方式中均检测到了二烯丙基二硫醚,这种物质是大蒜挥发油中典型的物质,且具有良好的杀菌作用,因此可以确定是大蒜根系分泌物中的化感物质。2种栽培方式收集的大蒜根系分泌物乙酸乙酯组分对萝卜种子发芽率和根长均有不同程度的抑制作用,表现为砂培>琼脂培,可能原因是砂培根系所受机械阻力大于琼脂培。根据这一结果初步判断,乙酸乙酯组分中所含的化感物质为2,6-二异丙基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚和二烯丙基二硫醚。根系分泌物不一定是化感物质,本试验采用砂培和琼脂培养2种方法收集大蒜根系分泌物,对强化感组分进行分析比较,结果将更为准确、可靠。本试验中三氯甲烷组分对萝卜的根长也有一定的抑制作用,该组分中的化感物质将有待进一步研究。采用琼脂培和砂培2种栽培方法对大蒜根系分泌物进行收集。采用砂培的方法收集大蒜根系分泌物,用不同极性的有机溶剂萃取,然后利用GC-MS对具有强化感作用的乙酸乙酯组分进行质谱扫描,图谱见图4,各成