棉花立枯丝核菌rhizoconiasolai的解磷和解钾能力

棉花立枯丝核菌rhizoconiasolai的解磷和解钾能力

木霉（tichoudma授粉）可以通过多种机制抑制植物病原体，为预防和控制疾病带来疾病，促进植物生长，并诱导植物抗病。这是预防和处理重要植物病害的重要机制。除了生防功能之外,已有研究发现绿色木霉、哈茨木霉等可以溶解难溶性无机磷酸盐以及金属矿物,为植物生长提供有效的磷素和矿物营养;也有关于木霉植酸酶活性的报道。本研究对从土壤中分离获得的木霉菌株进行多功能评价,包括拮抗、解磷、解钾、固氮及植酸酶活性等,然后对多功能木霉进行种类鉴定,为挖掘高效植病生防木霉资源提供依据。1材料和方法1.1土壤样品的采集土样采自山东聊城、寿光、临沂、章丘等4市有代表性的地点(西红柿大棚、黄瓜大棚、白菜种植区、韭菜种植区、大蒜种植区、葱种植区等),共采集土壤样品120份。木霉的分离采用稀释平板法,参照文献的方法进行。为防止木霉菌落过度扩张影响分离效果以及后续水解圈、抑菌圈的观察,除固氮能力测定外,其余实验均在固体培养基中加入体积分数为0.05%的TritionX-100,以限制菌落的扩展速度。1.2抗菌材料检测将待测木霉菌与立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)同步活化后,同时接种于PDA平板上对峙培养,平板直径为90mm,两个菌接种距离为50mm,72h后观察拮抗情况。1.3酶活剂的制备培养基:葡萄糖10.0g;(NH4)2SO40.5g,NaCl0.3g,KCl0.3g,MgSO4·7H2O0.3g,FeSO4·7H2O0.03g,MnSO4·4H2O0.03g,NaH2PO46.2g,琼脂18.0g,蒸馏水补足至1L,pH7.0～7.5,115℃30min灭菌备用。另配制50%CaCl2溶液,灭菌备用。用前每100mL培养基中加入2.0mL50%的CaCl2溶液,摇匀,倒平板使用。接菌后观察透明水解圈判定解无机磷能力。磷钒钼黄比色法测定液体培养基中的可溶性磷含量,计为(PO4)3-含量(μg/mL)。1.4u3000酸、碱、碱分别滴定聚合剂.培养基:葡萄糖5.0g,MgSO4·7H2O0.5g,FeCl30.005g,Na2HPO42.0g,CaCO30.1g,钾长石1.0g;蒸馏水定容至1L,pH值为7.0～7.4。四苯硼钠滴定法测定液体培养基中的可溶性钾含量,以KCl含量(μg/mL)计。1.5caso3.2g添加caso3.2o,caso3.2o法培养基:KH2PO40.2g,CaCO35.0g,MgSO4·7H2O0.2g,NaCl0.3g,甘露醇10.0g,CaSO4·2H2O0.1g,琼脂18g,蒸馏水定容至1L,pH=7.0。接菌后根据生长情况判断是否具有固氮能力。1.6分配规则培养基:植酸钙10.0g,葡萄糖20.0g,NH4NO35.0g,KCl0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.1g,MnSO4·H2O0.01g,琼脂20.0g。接菌后通过观察水解圈的有无,判定植酸酶活性。1.7木霉it1-5.8s-sa2段序列的扩增、测序及菌株种类检测采用形态学结合ITS序列测定比对法鉴定木霉的种类,利用通用引物ITS4、ITS5扩增木霉ITS1-5.8S-ITS2段序列,产物送上海生物工程技术服务有限公司测序,所得序列信息通过TrichoKEY软件进行序列比对,鉴定菌株种类。2结果与分析2.1重复寄生虫及产生抑菌圈通过对120份来自不同地区不同作物的土壤样品进行木霉分离,共获得244株木霉菌。通过对峙培养实验,244株木霉均显示出对棉花立枯丝核菌拮抗作用,表现为重复寄生以及产生抑菌圈,其中114株的抑菌圈明显可见。按照抑菌圈大小,结合重复寄生能力观察,选择其中的19个综合拮抗能力最强的菌株进行种类的分子鉴定、液体条件下解磷和解钾能力测定,这19个菌株为T8-4、T9-1、T13-8、T17、T18-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T34、T35-1、T38-5、T38-6、T44-1、T47-4、T57、T61-2、T62-2和T80-2。2.2木霉中的解磷圈在解磷培养基上,上述具有明显抑菌作用的114株木霉中,有74株产生明显的解磷圈,所有114个菌株在固氮培养基上无明显生长现象,因此推断这些菌株都不能固氮。2.3植物酸酶活性测定在平板上检测了上述114个菌株的植酸酶活性,发现所有菌株都能水解植酸钙,表明具有植酸酶活性,多数菌株的水解圈都超出了菌落覆盖范围。2.4-菌株磷值的测定菌液中可溶性磷、钾含量测定结果见表1。可以看出,19个木霉菌株在液体培养条件下对Ca3(PO4)2具有不同的降解能力,菌株T13-8、T23释放出的可溶性磷明显高于其他菌株,以(PO4)3-形式计,分别为1.792μg/mL、1.652μg/mL,菌液的pH值也明显降低,由起始pH=7.5分别降到pH=5.60和pH=5.79,表示解磷作用与pH值有一定关系。在液体培养条件下,有8个木霉菌株检测到了解钾活性,其中菌株T47-4的解钾能力明显高于其他菌株,释放培养基中的可溶性钾含量达20.585μg/mL(以KCl计),与报道过的细菌解钾能力(15.61μg/mL～55.9μg/mL)相当。2.5trc下3个菌株的trianum检测经过形态学和ITS序列比对鉴定,19株木霉属于4个不同的木霉种类,其中菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1等9个菌株为Trichodermalongibrachiatum;菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17等8个菌株为T.harzianum;菌株T61-2和菌株T18-1分别为T.virens和T.citrinoviride。3讨论和结论(1)可溶性磷的处理Anusuya等发现在液体培养条件下,T.harzianum,T.pseudokoningii和T.viride可降解磷酸钙释放出可溶性磷,培养液的pH值最终表现为降低。Rudresh等在研究木霉菌T.viride、T.virens、T.harzianum在液体培养条件下溶解难溶性磷酸盐时,也发现了同样结果。本研究发现多数木霉在固体和液体培养条件下具有解磷作用,故推断,解磷能力在木霉中是普遍存在的。在液体培养条件下,一些在固体基上有解磷圈的菌株并未检测到解磷活性,表明木霉的解磷活性与培养条件可能有密切关系。(2)木霉菌的酶活性1999年,Nasi等研究发现T.reesei同时具有植酸酶及酸性磷酸酶活性。本研究发现所有测定的114个木霉菌株都表现出植酸酶活性。植酸是土壤中磷被固定的一种形式,木霉由于产生植酸酶,能够释放被植酸所固定的磷素营养,供给植物吸收利用。(3)解钾能力的木霉菌目前报道的解钾微生物多为硅酸盐细菌,具有解磷能力的真菌报道相对较少,具有解钾能力的木霉菌的报道则几乎没有。本实验通过液体培养后检测,发现某些木霉菌株确实能够从钾长石中释放出可溶性钾,特别是菌株T47-4的解钾能力与已报道的解钾细菌能力相当。(4)木霉菌株鉴定在相关文献中至今没有发现具有固氮能力的木霉菌株。本研究所测试的所有木霉菌株,在无氮固体培养基上都不能生长,表明没有固氮能力,因而没有做进一步的固氮验证研究。(5)形态鉴定与生物学鉴定本研究所分离的木霉,都采集自山东省传统的蔬菜生产基地。通过形态鉴定与分子生物学鉴定,表明19个菌株属于4个木霉种类,其中17个菌株为长枝木霉或哈茨木霉,这两个种类应是山东省蔬菜田的优势种类。(6)木霉对黄瓜生长调节物质的作用作为植病生防菌,木霉是最重要的成员之一,也是迄今商品化次数最多的。木霉的抗菌特性是作为生防菌的首要条件,但考虑到商业化应用,也应当考虑到其他功能,例如肥料功能,或者刺激植物生长的能力。在这些方面,已经有人注意,例如1999年,Altomare等发现,T.harzianum菌株T22具有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力,通过螯合或降解作用来溶解金属氧化物,促进植物对矿物质的吸收,提高植物的生长量;2001年,Yedidia等发现木霉菌促进