碘硝基四唑紫法检测发酵制氢系统产氢效能的指标优化

碘硝基四唑紫法检测发酵制氢系统产氢效能的指标优化

0污水处理酶活性测定指标对于以厌氧化废水为基础的有机废水发芽法生物制氢系统，目前主要采用混合溶液中的蒸发悬浮固体（mlss，mlss）与总悬浮固体（mlss）之间的比率（mlpss/mlss）、生物污染（mlpss）的比（l/（gd）、cod去除率（%）和其他参数来表征发酵产生的氢污泥的活性。由于MLVSS中不仅包含了活性微生物细胞,同时也包含了无活性的,甚至是死亡的微生物残体及吸附的非挥发性有机物,以MLVSS/MLSS为指标将会高估污泥的生物活性,而以比产气(氢)速率为标准则会低估污泥的生物活性。在发酵生物制氢系统中,由于高分子有机物在发酵微生物菌群作用下转化成了低分子的有机挥发酸(VFAs)及醇类(同时释放H2和CO2),即便是在底物转化率较高的情况下,其COD去除率也是十分有限的,且会因发酵末端产物的变化而表现出很大的波动性,有时甚至出现负去除率的情况。因而,以COD去除率作为系统微生物活性的衡量指标也不够科学。脱氢酶是微生物活性细胞分泌的一种有机大分子,其存在水平可以客观反映废水生物处理系统中活性污泥的生物活性。目前,脱氢酶活性(DHA)测定的常用方法有氯化三苯基四氮唑(TTC)法和碘硝基四氮唑紫(iodonitrotetrazoliumchloride,INT)法。TTC的氧化还原电位(ORP)为+490mV,而INT的ORP为+90mV,因此INT对电子的亲和力要大于TTC。在厌氧生物处理系统中,底物的降解转化是在较低的ORP环境中进行,此时用INT作为电子受体来检测DHA,其效果可能更为显著。尽管采用INT法检测DHA并用于表征废水处理系统中污泥活性的研究已有报道,由于影响INT法检测效果的因素较多,欲以其作为表征产酸发酵系统污泥活性的指标,必须进行针对性的修正和优化。本研究以有机废水发酵法生物制氢系统的絮状厌氧活性污泥为对象,对影响DHA检测的INT浓度、pH值、萃取剂、终止剂、反应时间和温度等因素进行了实验与分析,以确定最佳检测条件,明晰与厌氧活性污泥比产氢速率的相关性,以期为发酵生物制氢系统微生物活性的客观及时监测提供科学方法,指导反应器的启动和运行。1材料和方法1.1样品的配制和分析方法活性污泥样品取自本实验室的厌氧折流板反应器(ABR)生物制氢系统,呈絮状,采集过程采用氮气保护。无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、乙醚、丙酮和终止剂甲醛、乙醇、三氯乙酸、98%浓硫酸等萃取剂,均为分析纯化学试剂;由美国Searchbio公司提供的INT标准样品(质量分数为99%),制成质量分数为1%(1.98mol/L)的储备液备用;缓冲液邻苯二甲酸氢钾溶液(pH4)、乙酸钠溶液(pH5)、磷酸二氢钾与磷酸氢二钠混合液(pH6、7)、Tris-HCl缓冲液(pH8、8.5)和四硼酸钠溶液(pH9),根据文献进行配置。萃取液吸光度使用752型紫外光栅分光光度计(山东高密彩虹分析仪器有限公司)测定,选用光程1cm、高度5cm的玻璃比色皿。其他主要设备包括:THZ-82型水浴振荡器(金坛市亿通电子有限公司)、FAN2004型电子天平(Hangping)、SPX1508型生化培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)和TGL-16G-B台式离心机(湖南星科科学仪器有限公司)等。1.2碘苯基四氮唑int--3-甲基苯甲织物.7.4的合成pH值、MLVSS等常规分析项目,均采用国家标准方法测定。在探讨各种因素对DHA检测的影响时,采用单因素多水平实验法,即在基础操作条件下,只改变所考查因素的水平,其他因素及其水平不变。基础操作方法为:向10mL的离心管中依次加入0.3mL的污泥样品(每升含2.7gMLVSS)、1.5mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH8.4)和1mL的0.1%INT溶液,迅速放在37℃的水浴振荡器内,暗处振荡反应30min,然后加入1mL的37%甲醛以终止酶反应;将终止反应后的样品在5000r/min下离心5min,弃上清液,加入5mL丙酮,混合搅拌均匀,在37℃下暗处振荡10min以萃取反应产物碘硝基四氮唑甲簪(INF,红色);在5000r/min下再离心5min,并在485nm处测定萃取液吸光度。比脱氢酶活性通过下式计算:式中,UI为污泥样品的INT-比脱氢酶活性(μmol/(g·min)),A为最适波长处的萃取液吸光度,V为萃取剂体积(mL),K为INT-A标准曲线的斜率,W为污泥样品MLVSS干重(mg),为暗培养时间(min)。INT-A标准曲线将在确定最优条件后制作,并由其求得系数K。2结果与讨论2.1卓测条件优化2.1.1酶促反应产物萃取液ph的测定在基础操作的基础上,在波长420~500nm范围内考查了分光光度计发射波长对酶促反应产物萃取液吸光度的影响。结果表明,在波长为438nm处,INF萃取液(丙酮)具有最大A值,为0.64。后续实验将采用这一波长检测INF萃取液的吸光度。2.1.2酶反应时间及温度在基础操作条件下,首先对影响INT-比脱氢酶活性测定的INT浓度、暗反应时间、反应温度和不同缓冲剂等进行了试验(表1)。结果表明,①在INT溶液的浓度从0.01%(19.8mmol/L)逐渐增加到0.1%(198mmol/L)时,萃取液的A值从0.18大幅提高到0.51;当INT浓度继续逐步增加到0.8%时,A的增加值只有0.17,增加趋势不再显著。②当酶反应时间从10min增加到30min时,反应产物萃取液A值从0.14提升到了0.25,反应时间继续增加时,A值的增加不再明显。③根据目前报道的发酵生物制氢研究常采用的发酵温度范围,在进行DHA测定中,当温度从25℃逐步提高到45℃时,所测反应产物萃取液A值从0.20增加到了0.37(表1);温度继续升高时,A值则表现出下降趋势。④在不改变缓冲液加入量(1.5mL)的前提下,采用pH5的乙酸钠溶液作为缓冲剂时,反应产物萃取液的A值最大,为0.58;而在其他缓冲剂条件下,测得的A值均偏低,处于低于0.28的水平。以上试验结果表明,INT-比脱氢酶活性测定的INT浓度、酶反应时间、反应温度及缓冲剂分别选择198mmol/L、30min、45℃和pH5的乙酸钠溶液比较适宜。2.1.3n条件下各种终止剂的体外药物萃取为精确计算DHA,应合理选择酶反应终止剂,以保证酶反应在设定时间及时终止。在确定反应时间为30min的条件下,三氯乙酸、甲醛、乙醇和浓硫酸等4种终止剂的试验结果(图1)表明,这4种终止剂都可以有效地终止酶反应,在终止反应后的5min和10min,萃取液的A值均无显著变化。但从INF萃取液的A值大小分析,浓硫酸则显著优于其他3种终止剂,其A值可达0.42以上,而其他3种终止剂的A值则在0.28以下。2.1.4萃取剂的选择为提高酶促反应产物INF萃取效果,在基础操作的基础上,分别考查无水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、乙醚和丙酮等7种萃取剂的萃取效果(图2)。结果表明,以乙醇为萃取剂时,反应产物萃取液A值最高,为0.53,显著高于其他几种萃取剂的A值。以乙醇作为萃取剂,有对人体无害的优点。2.2标准曲线的绘制根据单因素多水平试验得到的INT-比脱氢酶活性测定优化操作条件,即可制作INT-A标准曲线:取适量1%的INT储备液,用pH5的乙酸盐缓冲液将其稀释成摩尔浓度分别为98,198,395,790,1581mmol/L的标准梯度溶液,分别加入质量分数为7%的抗坏血酸0.2mL,振荡摇匀,45℃下暗处振荡反应30min,然后加入1mL的浓硫酸终止酶反应;反应混合液在5000r/min下离心5min,弃去上清液,加入5mL无水乙醇,45℃下暗处振荡萃取10min,5000r/min离心5min,438nm处测定上清液A值,由此得到INT-A标准曲线(图3),其方程为式中,x为萃取液中的INF浓度(μmol/L),y为相应的A值。x与y具有很好的相关性,判定系数R2达0.9952。由式(2)得到斜率常数K=0.0111,带入式(1)即得到比脱氢酶活性UI计算公式:2.3mlvss脱氢酶活性的测定从ABR制氢反应系统不同部位,采集不同浓度的厌氧活性污泥(絮状)样品。向10mL的离心管中依次加入0.3mL的污泥样品(MLVSS:2.66~26.64g/L)、1.5mL的乙酸盐缓冲溶液(pH5)、1mL的0.1%INT溶液;在45℃的水浴振荡器内暗处振荡反应30min,然后加1mL的浓硫酸终止酶反应;在5000r/min下离心5min,弃去上清液,加入5mL无水乙醇,混合搅拌均匀,在45℃下暗处振荡10min,萃取反应产物INF;在5000r/min下再离心5min,并在分光光度计的438nm处读取A值。以污泥样品的浓度为横坐标,相应A值为纵坐标作图,即得到污泥浓度-A值曲线(图4)。结果表明,MLVSS在2.66~26.64g/L的范围内,与A值呈现很好的正相关性,R2达到了0.9939,说明INT法均能有效检测脱氢酶活性。为减少误差,A值处于0.2~0.7的范围比较理想,根据图4给出的线性回归方程计算,相应的MLVSS应在3.5~12.5g/L范围。实际检测中,污泥样品的MLVSS建议采用9g/L。2.4数据处理和分析在ABR进入HRT30h、进水COD8000mg/L的运行阶段,对前两个格室中活性污泥的比产氢速率和INT-比脱氢酶活性进行连续检测和分析,结果如表2所示(第1次取样计为第1天)。采用MicrosoftExcel中的Correl函数分别对两个格室活性污泥的比产氢速率和INT-比脱氢酶活性两组数据进行相关性分析,其相关系数分别为0.92和0.94,均大于0.8,说明活性污泥的INT-比脱氢酶活性与比产氢速率非常高度相关。可见,INT-比脱氢酶活性这一参数,可以客观准确地反映厌氧生物制氢系统污泥的产氢活性。3含氟低硫酸钠缓冲剂提取细胞系数和用量1)通过单因素多水平实验,确定了产酸发酵生物制氢系统厌氧活性污泥INT-比脱氢酶活性检测的适宜条件,即10mL离心管中,先后加入0.3mL的污泥样品、1mL198mmol/L的INT