猪瘟病毒实时定量pcr检测方法的建立及应用

猪瘟病毒实时定量pcr检测方法的建立及应用

猪疫情是一种急性、热和高度接触性传染病，在全世界广泛分布。这是兽医行业严重经济损失的重要疫情之一。猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员。该病毒属其他重要动物病原还包括能够造成犊牛腹泻的牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus,BVDV)和感染羊的边界病病毒(borderdiseasevirus,BDV),这2种病毒都可以自然感染猪。猪猪瘟瘟病病毒毒全全基因组长约12kb,编码一个大的开开放放阅阅读读框框((ooppeennreadingframe,ORF),基因组2端端具具有有非非编编码码区区。ORF编码的多聚蛋白在病毒和细细胞胞酶酶的的作作用用下下被分解成为4个结构蛋白(C,EErrnnss,,EE11和和EE22))和和8个非结构蛋白(Npro,p7,NS2,NNSS33,,NNSS44AA,,NNSS44B,NS5A和NS5B)。系统进化分分析析表表明明CCSSFFVV可可以分成2个基因群:基因群I包含含的的主主要要是是弱弱毒毒毒毒株,而基因群II包含的主要是强毒力毒株。非编码区基因相对保守,通常被用来作为检测对象。猪瘟病毒的诊断方法及疫苗研究是近年来的研究热点。多种诊断方法已经被广泛应用于临床,如病毒分离、血清学诊断试验、RT-PCR方法、基因芯片等。但这些方法存在操作复杂、灵敏度低或成本过高等问题,不适合用于大规模检测,尤其是对病毒进行高灵敏度的定量分析。SYBRreal-timePCR方法对分析病毒组织定位及检测病毒含量较低的样品具有显著优势,本研究为分析急性感染期猪瘟病毒的组织定位,分析猪瘟病毒感染导致猪急性死亡的致病机理研究,建立了能够检测猪瘟强毒的SYBRreal-timePCR方法,并以此分析了猪瘟强毒在人工感染猪体内的分布。1材料和方法1.1sybrpeq和rna提取试剂盒猪瘟石门系强毒毒株由本实验室保存。SYBRPremixExTaq购自TAKARA公司,RNA提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。1.2接种猪景观血毒后注射3.从农户饲养的猪中选择猪瘟抗原抗体阴性断奶仔猪,攻毒组和对照组各5只。以点眼、滴鼻和注射的方法接种猪瘟血毒10mL。对照组以相同方法注射等量的生理盐水,攻毒组与对照组严格隔离饲养。选择急性发病猪(接种后5~7d死亡),采集心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、脑、骨髓、扁桃体、回肠、血清和肠内容物,-20°C保存以备使用。1.3软件设计及引物设计根据GenBank发表的猪瘟石门强毒的基因序列,选择5′UTR相对保守区域,利用Primer5软件设计出1对引物,P1:5′-GCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3′;P2:5′-CCCT-CGTCCACATAGCATCT-3′,长91bp。扩增条件为:55℃退火30s,72℃延伸40s。套式PCR引物序列参考文献,普通PCR为外出引物扩增结果,引物由华大基因合成。1.4阳性克隆的制备将猪瘟病毒PCR扩增产物纯化后与pMD-18T连接,转化DH5α,挑取阳性克隆,经酶切鉴定后,送于华大基因测序。测序正确的质粒经质粒提取试剂盒提取后,测定浓度作为制作real-timePCR标准曲线的标准品,质粒命名为pMD-CSFV-5′UTR。1.5实时荧光定量pcr反应反应体系20μL:2×SYBRPremixExTaq10μL,上、下游引物(20μmol/L)各0.5μL,模板DNA1μL,ddH2O补足20μL。使用BIO-RADQ5型荧光定量PCR仪进行反应。反应程序采用2步法:94℃预变性30s,94℃变性15s,60℃退火40s,共反应40个循环,每个循环的退火阶段收集荧光信号。1.6标准曲线的绘制连续10倍比稀释标准品,选择10-9~10-4倍稀释点进行荧光定量PCR,绘制标准曲线。用该荧光定量PCR方法对阳性标准品的3个稀释度(10-7、10-6、10-5)进行重复性检测,每个稀释度组内设3个样本,组间重复3次,统计组内和组间的平均值、标准差和变异系数。1.7特异性试验1.8荧光定量pcr检测基因转录水平对采集的各组病料,包括心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、脑、骨髓、扁桃体、回肠、血清和肠内容物提取RNA,反转录后进行荧光定量PCR的检测。每个样品设3个重复,每次荧光定量PCR都设标准曲线。2结果2.1引用特异性用引物P1、P2对病毒cDNA样本进行扩增,产物大小约为91bp,与预计产物大小一致,扩增条带单一、无非特异扩增(图1)。2.2相对分子质量测定DNA标准品D260值,按照公式:病毒量(拷贝/mL)=50(g/mL)×D260×6.02×1023(拷贝/mol)/1000×相对分子质量(g/mol)。计算出pMD-CSFV-5′UTR的拷贝数是8.7×109拷贝/mL。2.3检测下限和效率标准曲线在8.7~8.7×105拷贝范围内呈现良好的线性关系,相关系数为R2=0.996,扩增效率为107.2%,检测下限为8.7拷贝(图2)。扩增曲线呈的S型,溶解峰值单一,Tm=82.3±0.10℃。计算公式为:y=-3.16x+9.89。2.4特异性试验验Real-timePCR只对猪瘟病毒有扩增曲线,其它均无扩增产物(图3)。2.5间标准偏差、变异系数测定组内重复标准偏差、变异系数、组间标准偏差、变异系数。变异系数均小于5%(表1),表明标准曲线具有较高的重复性,可以检测样品使用。2.6荧光定量pcr与质粒模板pcr的对比比较普通PCR和套式PCR与real-timePCR对质粒模板的扩增效率,发现套式PCR和荧光定量PCR具有相似的灵敏度,比普通PCR的扩增效率高出1000倍作用(表2),适合用于研究病毒含量较低的试验材料。2.7csfv在不同病理生理指标中的含量对各种组织和体液样品检测结果显示,Real-timePCR扩增曲线良好,溶解曲线峰值单一,无其他杂峰(图3)。依据标准曲线公式,计算出病料中病毒含量,结果见图4。由图4可以看出,扁桃体中CSFV含量最高,脾脏和回肠次之,接着是淋巴结,肝脏、肾、骨髓和脑中CSFV基因的含量较低,心、肺、血清中CSFV基因含量也比较高。对照组猪未检出病毒RNA。3猪髓病毒在组织中的分布猪瘟是导致我国养猪生产损失的重要疾病之一。目前已经有许多研究团队对该病毒做出了深入的研究,但时至今日,仍然未能够完全揭示猪瘟病毒的致病机理、变异机制、地理分布、组织嗜性和排毒情况。为深入研究病毒侵入机体后的组织定位及与猪急性死亡的关系,本研究建立了SYBR荧光定量方法,并以此分析了急性感染死亡猪体内器官:心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、脑、骨髓、扁桃体、回肠、血清和肠内容物中的病毒含量。结果发现病毒主要集中在扁桃体、脾脏、淋巴结、回肠内。另外研究发现病毒在血清、肠内物中含量也较高,这可能与病毒的排毒有关。说明急性感染期的猪已经可以通过肠道排出物向外排毒。本次研究测定的组织病毒含量与Ophuis等报道的结果相似,但与Liu等报道的差别较大,这可能与使用的病毒毒株有关。分析急性感染期猪瘟病毒在组织的分布情况,可以了解病毒在猪体内传播的过程。从结果看出扁桃体含病毒量最高,符合病毒从口鼻途径感染,病毒复制起始于扁桃体的事实;其次病毒在淋巴结和脾脏中的含量也较高,证明病毒可以侵袭这些组织,并可以在这些组织中复制,产生子代病毒粒子,这些组织器官可能是病毒侵入机体后的优先“着陆”位点;另外血液中病毒含量也较高,说明病毒可以通过血液向全身传播。检测结果还显示:在动物的心脏、脑、骨髓、肾和肝脏中都有病毒的存在。这些结果说明急性感染期,猪瘟病毒已经广泛在猪体内多种组织器官中分布,这可能是导致猪急性死亡的原因,另外还证明淋巴组织在猪瘟病毒建立感染和病毒增殖中扮演重要较色。用荧光定量PCR方法分析感染猪体内病毒分布的研究已经有报道,赵建军等用Taqman探针法分析了人工感染猪1~14d血液中猪瘟病毒的动力学变化;Jun等用荧光定量PCR方法分析了CSFVSM毒株感染猪后病毒在猪体内的分布;国外学者也报道了用荧光定量PCR方法分析猪瘟病毒组织分布的研究进展,但是多数情况下,试验用猪没有在急性感染期内发病死亡,因此