植病生防菌遗传改良技术的研究进展

植病生防菌遗传改良技术的研究进展

使用化学洗涤剂是控制农业疾病的主要方法。使用化学洗涤剂频繁使植物病原体产生抗药性，不仅可以有效控制疾病，还会增加环境。以生防菌为基础的生物杀菌剂虽然目前在整个世界植物保护市场中所占的分量不到0.1%,但已受到各行业的广泛重视,成为当前世界农业研究的热点与重点。生防菌的研究开发必须以现有野生菌为基础,要获得能够有效防治农业中重要病害的生防菌,就要对现有生防菌进行改良。通过改良获得的工程菌较传统的生防菌优势明显,如杀菌谱更宽、毒力提高、抗紫外线、田间药效长、虫病兼治、生物防治效率高等。这种改良后的产品较传统的生物杀菌剂将具有更高的生防效率和更强的市场竞争力。例如世界上第一个商品化的遗传工程杀菌剂商品NOGALLTM,是通过K84菌株的遗传改造获得的。本文将对植病生防菌的遗传改良技术及产业化作一综述。1改良植物、疾病生殖器和细菌的技术对生防菌进行改良的目的是要增强生防菌的抗菌活性和扩大防治对象等。这些改良技术主要包括诱变育种、杂交育种及基因工程技术等。1.1紫外线诱变对菌株的生化影响诱变育种是通过人工方法处理微生物,使之发生突变,运用合理的筛选程序和方法,把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率,使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株,应用于生产和研究。诱变主要包括化学诱变和物理诱变。Ahamad和Baker用Trichodermaharzianum通过亚硝基胍诱变得到了苯菌灵抗性菌株,其中两株的纤维素酶产生能力明显高于野生型菌株,其根际定殖能力显著改善,他们推断纤维素酶活性的提高与木霉菌根际定殖能力的强弱有相关性。紫外线诱变相对于化学诱变来说是一种比较简便而又可靠的方法。1983年Papavizas等以对苯菌灵的敏感性为标记,用紫外线对木霉菌进行了诱变,得到了对苯菌灵等MBC类杀菌剂有抗性的菌株,从而用木霉菌和MBC类杀菌剂制成了复合制剂。在诱变过程中,不同筛选标记得到的突变株具有不同的效力。杨合同等通过对绿色木霉菌的紫外线诱变处理,根据不同的筛选标记,得到了两个突变株LR和LRR,LR寄生能力强,产孢量大,分枝多,并且可以在低温条件下正常生长;LRR则对多菌灵表现出一定的抗性。棉花病害防治试验表明,两个突变株对立枯病,枯萎病和黄萎病的表现不同。对于立枯病的防治,LRR的效果比野生型菌株LTR-2略有提高,而LR的防治效果完全丧失;对于枯萎病和黄萎病,LR防治效果明显提高,而LRR的提高幅度相对较小。可见,虽然紫外线诱变可以得到优良的突变株,但对于不同的病害来说,筛选标记不能雷同,以防止防病效果的丧失,如同LR对立枯病的情况一样。因此,如何在突变体中选择优良菌株,确定合适的筛选标记是非常重要的。通过诱变育种还可以提高抗生素产量,如芽孢杆菌ATCC815spoOA和abrB双突变后,Tyrocidine生物合成变成组成性表达,产物浓度是野生菌株的8倍。1.2原生质体融合技术杂交育种是将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合,随后细胞核进行减数分裂,遗传性状会出现分离和重新组合的现象,产生具有各种新性状的重组体,然后经分离和筛选,获得符合要求的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法,但是某一菌株长期使用诱变剂处理后,其生活能力一般逐渐下降,如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢、诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此,常采用杂交育种的方法继续优化菌株。由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本,不论在方向性还是自觉性方面,都比诱变育种前进了一大步,所以它是微生物菌种选育的另一重要途径,包括常规杂交和原生质体融合,其中原生质体融合技术近年来发展较为活跃。原生质体融合(protoplastfusion)亦称细胞融合(cellfusion),是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞,使一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA和核外基因都进入另一个细胞。其整个过程包括:遗传标记筛选,原生质体的制备、融合与再生,融合子的鉴定。该技术起源于20世纪60年代,自1974年匈牙利的Ferenczy报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合后,原生质体融合育种已从微生物种内融合扩展到界间融合。该技术没有细胞壁的阻碍,不需要有已知的遗传系统,融合后两新株的整套基因组相互接触,使优良性状通过融合再组合到一个新菌种中。近年来,许多产抗生素链霉菌融合相继获得成功。曾洪梅等以武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷素变种的两个突变株M35和M46进行原生质体融合,获得比原始菌株效价提高82%的重组体菌株F31-24,扩大了农抗武夷菌素的应用范围。木霉是一种具有重要利用价值的拮抗性真菌,被广泛用于植物病原菌的防治,有几个国家已生产出木霉制剂,但效果不够理想。木霉不具有有性生殖,无法运用常规育种手段进行种内、种间杂交育种,原生质体融合技术为木霉菌育种提供了有效途径。Sivan和Harman用哈茨木霉进行了原生质体融合试验,融合子的防病效果可与福美双比美。1993年,Harman,等将哈茨木霉菌株T95的赖氨酸和组氨酸缺陷型株系融合,选出比亲本菌株拮抗谱广泛,根际定殖能力强,防病效果好的融合子,并以F-Stop为商品名进行了注册登记。以上及目前用的木霉大部分是营养缺陷型菌株或具有抗药性突变菌株,这样可能丢失亲本菌株中与生防活性有关的一些特性。最近有报道,利用具有天然抗药性的木霉菌株进行原生质体融合,获得的融合子会保持亲本菌株的优良特性。杨合同等利用产孢量大,对苯菌灵有抗性,对潮霉素B敏感的哈茨木霉T9和产孢量少,对潮霉素B有抗性,对苯菌灵敏感的康宁木霉Tk7a为亲本,进行原生质体融合,筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子。所有融合子的产孢量均比亲本菌株Tk7a大。大部分融合子的几丁质酶、葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性比亲本菌株高。融合子对棉花猝倒病菌和小麦全蚀病菌的寄生能力基本等同于亲本菌株;融合子对小麦全蚀病的防效比亲本菌株稍好,其刺激麦苗根部生长的能力与亲本菌株相差不大。两个融合子根际竞争能力比亲本菌株强,和亲本菌株Tk7a相当。1.3基因序列重组菌株的构建和复配基因工程的发展,给植物病害生防菌的培育开辟了新的途径。基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等,是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接,转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。因此比其他育种方法更有目的性和方向性,可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种,是当前最先进的育种技术。其全部过程大体分为6个步骤:目的基因的获得;载体的选择;含目的基因的DNA片段克隆入载体中构成重组载体;将重组载体引入宿主细胞内进行复制、扩增;筛选出带有重组目的基因的转化细胞;鉴定外源基因的表达产物。通过基因工程手段将目的基因导入到受体细胞中,是目前增强微生物拮抗活性的有效途径。Limon等利用amS基因以及木霉菌本身的几丁质酶基因chit33共转化哈茨木霉菌CECT2413获得过量组成型表达33kDa几丁质酶的哈茨木霉转化子,同野生型菌株相比,该菌株对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的抑菌活性明显提高。本实验室将来自芽孢杆菌的几丁质酶基因通过自杀性质粒整合到伯克氏菌B418的染色体DNA上,获得了稳定高效的转化子(未发表)。通过重组技术还可以扩大生防菌的防治对象,中国农科院黄大日方实验室通过质粒载体将Bt杀虫蛋白基因cryIAc毒性编码区导入水稻生防芽孢杆菌B916,室内试验显示重组菌株具有良好的杀虫防病作用和很好的遗传稳定性。对生防菌的遗传改良是获得优良生防菌的有效途径,尤其是基因工程技术的出现可以有目的地对生防菌进行改造,使生防菌获得兼治多种病害的功能。但由于不少生防菌结构复杂,遗传操作比较困难,因此,有关改良技术还需要进一步的研究。2研究中的挑战微生物农药的产业化要求在“八五”末期(1994年)开始提出,在“九五、十五”期间将产业化的问题作为一个衡量指标引入微生物农药品种的攻关研究中,这不仅是社会的一种进步,而且是市场对研究工作者提出的一种要求和挑战。植病生防菌的产业化包括两个方面:从技术的角度来说要加强生防菌的改良技术及其应用,建立生防菌的改良系统,加强生防菌产品的质量控制;从管理的角度来说,加强市场的竞争和市场开拓。2.1植物病害生物防治农药以植病生防菌为有效成分的微生物农药主要分为细菌类和真菌类。细菌类研究较多,国际上已经有商品化制剂生产的生防菌主要是芽孢杆菌和假单胞杆菌。我国1959年从前苏联引进苏云金芽孢杆菌(Bt),1965年在武汉建成国内第一家Bt杀虫剂工厂,开始生产Bt杀虫剂,代号叫“青虫菌”。到目前为止,生产Bt的厂家有46家,年产制剂量达3万吨左右,年应用面积5000多万亩次。除Bt外,开发成功的细菌制剂还有亚宝(枯草芽孢杆菌),力宝(假单胞杆菌),增产菌(蜡质芽孢杆菌)。中国登记注册的植物病害生物防治农药,细菌类共有6个,分别是2个Bacillussubtilis,1个转基因Pseudomonascepacia(台湾在大陆登记注册);2个Pseudomonasfluorescens:蚀敌,消蚀灵;1个Bacillussp.+Pseudomonassp.;其中蚀敌和消蚀灵为山东省科学院的成果,一个枯草芽孢杆菌为中国农业大学、云南农业大学和山东省科学院的合作研究成果。真菌类研究较多的主要是木霉。在中国登记注册的共有4个,分别是Trichodermaspp.:灭菌灵;Trichodermaviride:杀霉特,特立克和灵霉素,其中后三种为山东省科学院的研究成果。国外登记注册的植物病害生物防治农药,细菌类共有18个,真菌类共有30个。上面提到的这些商品化制剂大部分是非转基因菌株。2.2微生物农药发酵生产的关键技术我国加入WTO后,农业发展机遇和市场竞争同时存在,提高我国农产品在国际贸易市场上竞争力的重要内容是降低有毒化学物质在农产品中的残留量,采取的主要对策是使用微生物农药防治水稻、小麦等农作物的重大病虫害。微生物农药使用的前提是获得优良生防菌,主要通过分离筛选或改良技术完成。获得的生防菌,包括改良后的生防菌,要进行大面积的推广应用,必须进行产业化生产。其中使用的最佳发酵配方与适宜的工艺流程是提高微生物农药菌剂防治效果、降低生产成本的关键问题,这就要研究其发酵生产的培养基配方、最适生长的条件等产业化生产关键技术。生产中需要按照工厂的实际条件研制出更加合理的、完整的生产工艺,这需要技术持有方和生产单位经过相当一段时间的共同努力,才能逐步实现生产技术的转移,实现品种的商品化生产并过渡到产业化阶段。2.3生防菌的改良技术以生防菌为有效成分的生物农药在农药市场中面临着化学农药的强大竞争,并且一个效果良好的产品,需要3～5年的时间才能打开市场。新产品要实现产业化,首先要进行商品化生产,并占据相对稳定的市场份额,且企业的最终目标是要赢利,只有实现规模生产和经济效益,才能实现生防菌的产业化。在生防菌的产业化方面,关键的一点是科研单位与企业的联合、创新。我国目前大部分生物农药生产企业规模偏小、品种单一、效益不高,科研单位和企业很难合作,因此要加强改革力度,规范科研单位和生产厂家的行为,更好的促进成果转化和产业化进程,并且做好市场的宏观调控,国家要给予要互的支持和