穿孔素的结构、表达与调节机制及免疫调节作用

穿孔素的结构、表达与调节机制及免疫调节作用

穿孔素（tcl）是一种存在于细胞毒性t细胞（ctl）和自然损伤细胞（nk）细胞血浆中的糖蛋白。近年来,有关PFP的研究日益活跃,对PFP蛋白质结构、表达与调节机制、PFP介导的细胞毒效应在抗感染免疫中的作用以及PFP的免疫调节作用进行了广泛深入的研究,本文就这些方面的研究进展作一综述。1egf分子的结构变化和活性穿孔素是一种糖蛋白,结构类似于补体C9,由534个氨基酸组成,N端的40个氨基酸和C端约100个氨基酸为PFP分子所独有,成熟前在N端还含有一个由20个氨基酸组成的引导肽。N端的19个氨基酸具有与整个PFP类似的溶解靶细胞的活性,PFP分子内部的190~203位氨基酸残基能够折叠成双歧性的α螺旋结构,356~386位氨基酸残基为富含半胱氨酸的EGF受体前体区域,388~519位氨基酸残基折叠成由8个β片层组成的结构,末端是与δ磷脂酶C(PLC-δ)类似的C2功能区域,包含3个Ca2+结合位点,能够与靶细胞膜中的磷脂结合。C端的19个氨基酸残基对于PFP的正确折叠后离开内质网很重要,缺失这19个氨基酸残基的PFP不能进入分泌颗粒而留在内质网中。2il-2和tgf-穿孔素主要由成熟的NK和激活的CTL细胞合成和分泌,它的表达主要受细胞因子的调节,这也是细胞因子发挥免疫调节功能的一个重要方面。多种细胞因子,包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12和IFNs等都能够增加PFP表达。rIL-2能在18~30h内使外周血单个核细胞的PFPmRNA水平上升5倍。IL-2和IL-7通过诱导和活化NK细胞内信号传导和转录活化蛋白5a/b的异二聚体化与启动子中的STAT结合位点结合而刺激PFP转录,IL-6则通过诱导STAT1α的合成而刺激转录。转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)可抑制PFP和颗粒酶的表达而降低细胞毒作用。同时穿孔素表达降低与感染的慢性化以及病毒的致病力都有关。在肿瘤发生发展及病毒感染的过程中,虽然CTL数目增加,但分泌穿孔素等物质的能力却大大减低。研究还显示,HIV感染中CTL的穿孔素含量(即CTL分化程度)与艾滋病进展程度有关。YangOO等的研究表明,HIV感染患者穿孔素和颗粒酶表达明显减少,进一步导致CTL的衰老和功能减低,从而使病情发展。3cd4+cd8+t间接杀伤靶细胞在体内,免疫毒性细胞杀伤靶细胞的途径和机制主要有两种:(1)FAS途径经死亡受体起作用。(2)毒性颗粒途径。当CTL和NK细胞受到抗原刺激后,效应靶细胞识别,胞浆颗粒重定向,移至效应靶细胞接触部位,通过出胞作用以分泌性溶酶体形式将这些毒性颗粒释放到细胞间隙。毒性颗粒成分主要包括穿孔素和颗粒酶。免疫毒性细胞杀伤靶细胞的途径主要依赖于细胞类型,其次为靶细胞上FasL的表达及敏感程度等。在CTL中的CD8+T细胞几乎完全依赖穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞和病原体,双阴性的CTLs细胞毒性是FasL/Fas相互作用介导的,对病原体活力无影响,而CD4+CD8+T可通过任一途径杀伤靶细胞。穿孔素被细胞分泌后,在Ca2+存在的条件下,PFP单体分子N端的β2折叠区域构像首先发生变化,从而导致亲水性的PFP分子的两歧性(amphipathy)区域暴露而改变成两歧构像,从而能够结合、插入感染细胞的细胞膜的脂质双分子层,通过所谓的“桶棍模型”,PFP单体以进行性增添的方式形成不同直径的小孔。10~20个单体才能聚合成一通道,这些通道的内径在5~20nm之间,内侧由单体的亲水性氨基酸残基构成,疏水性残基则向着磷脂双分子层。该通道失去对离子通道的选择性,可以令水分子、离子以及其他小分子物质进入靶细胞内,而大分子物质流出细胞外,靶细胞内渗透压改变,细胞膨胀,细胞膜破裂导致细胞渗透性溶解(膜坏死)。同时,颗粒酶B(GrB)通过PFP在靶细胞膜上形成的通道进入靶细胞浆,在靶细胞浆内再分布,集中于细胞核,在PFP的帮助下进入细胞核,并嵌入DNA中启动凋亡机制使其发生程序性死亡(凋亡)。但是,PFP单独作用引起的膜管型的损害并不一定引起细胞死亡,因为靶细胞在受到PFP作用后即可启动细胞的修复程序,修复被PFP攻击的膜从而避免细胞的坏死;如果在修复过程中靶细胞发生吞饮作用,将GrB小囊泡摄入,细胞还是会发生凋亡,此称GrB的协同作用。在无PFP存在的情况下,GrB也能够通过能量依赖途径穿过细胞膜,进入细胞浆内,但并不引起细胞的明显损害,这是因为PFP可引发凋亡和影响GrB向细胞核内转移,这又称作PFP协助下的内解离(internaldisintegration),即PFP的间接杀伤功能。因此,虽然GrB不需要PFP的辅助也能够自主进入靶细胞,但是PFP对凋亡过程的起始和GrB进入细胞核内起关键作用。4儒家思想的缓解4.1cd8+t细胞增殖实验证明穿孔素基因被剔除(perforinknockout,PKO)的小鼠在超抗原、病毒等刺激时,抗原特异性CD8+T细胞扩增加强,清除延迟,而且不能用抗原提呈细胞(APC)功能减弱来解释。NatalyaV等用免疫组化法证明在结核中穿孔素能调控CD8+CTL细胞的活性。这一切表明穿孔素介导的细胞毒作用在体内CD8+CTL细胞应答中有自稳调节作用,但具体机制目前还不清楚。4.2t细胞内吞形成内推HuangJF等实验表明,APC表面的抗原肽-MHC复合物(pMHCs)可转移到特异性T细胞表面上,并通过TCR介导的内吞作用内化。当抗原浓度较高时,高密度的pMHCs转移到特异性靶细胞表面被重新提呈后,可被已激活的CTL杀伤。4.3穿孔素调节apc的抗原提呈肿瘤gp96抗原是一种抗原性很强的抗原。试验证明PKO小鼠即使用肿瘤gp96抗原刺激,也不能导致NK细胞激活或CTL扩增,说明穿孔素能够调节APC的抗原提呈。同时还有试验证明肿瘤细胞可通过表达MHC-I类抗原,阻碍穿孔素/颗粒酶途径,说明能够调节APC的抗原提呈也就能够调节CTL依赖的穿孔素的细胞毒作用。穿孔素和APC抗原提呈的负反馈调节可防止T细胞的过度活化并下调免疫应答。4.4调节细胞炎症活性PFP-鼠Ig增强,穿孔素对自身免疫病易感动物的保护作用都证明其对B细胞功能的调节作用,具体机制不清楚。另外,穿孔素可调节其它杀伤颗粒成分的炎症活性。CTL、NK杀伤颗粒中的颗粒酶A在细胞外具有促炎症活性,可诱导人类肺成纤维细胞产生IL-6、IL-8。CTL受抗原刺激时,30%的颗粒酶A被分泌到细胞外,穿孔素存在时主要诱导靶细胞凋亡,穿孔素缺失时则超水平发挥炎症活性,导致免疫病理损伤。5cd4+ctl的来源由于在抗感染、抗肿瘤及自身免疫中所起到的重要作用,穿孔素近年来十分被重视。目前对于穿孔素的认识还很局限,许多问题有待解决,如穿孔素如何调节APC、B细胞及外周活化CTL细胞的功能;穿孔素如何参与CTL对活化的抗原特异性T细胞的直接杀伤过程;穿孔素如何调节其它杀伤颗粒成分的炎症活性及穿孔素究竟来源于哪种细胞等。过去认为穿孔素只是由NK和激活的CTL细胞合成和分泌,但是近来研究发现,一些人和鼠CD4+T细胞也表达PFP。用HIV-1包膜蛋白抗原从CD4+T亚群中诱导出CD4+CTL,免疫组化结果显示其胞浆颗粒中有PFP表达,这些CD4+CTL约占T细胞总数的20%。那么这些CD4+CTL究竟是什么来源,笔者认为可能有三种情况:(1)是CD4+CD8+(DP)T细胞,已经有学者证实在免疫原的激发下,循环血或组织中的CD4+单阳T细胞可转化为DPT细胞,CD8+单阳T细胞也可转化为DPT细胞,DPT细胞再通过穿孔素和颗粒酶破坏靶细胞或直接杀灭病原体而发挥免疫保护作用。有学者提出CD4+T细胞上CD8+抗原表达是CD4+T细胞活化的表现。(2)是自然杀伤T细胞(naturalkillerTcells,NKT):NKT是一类区别于自然杀伤细胞(NK)细胞、B细胞以及传统的T细胞的另一种T细胞亚群,它既具有T细胞受体又有NK受体,根据CD4/8的表达看,可将其分为:①CD4+-NKT细胞;②CD8+-NKT细胞;③CD4-CD8-的DN-NKT细胞。NKT显示T细胞和NK细胞双重性质,可以通过TCR或细胞因子活化作用激活,产生大量的细胞因子包括穿孔素和颗粒酶,杀伤靶细胞。NKT细胞与T细胞的不同之处在于T细胞分化为功能不同的Th1和Th2细胞群,而NKT能分泌Th1和Th2细胞因子,同时还具有与CD8+CTL细胞相同的杀伤靶细胞作用。(3)也可能来源于CD4+单阳T细胞。如果能设计一种