条斑紫菜状细菌的分离鉴定

条斑紫菜状细菌的分离鉴定

1844年，欧石发现并命名了绿芝麻菌，属于硫发生植物科。毛霉亮发菌是一种常见的形态独特的海洋细菌,一般营附着生活,常附着于海洋动植物的体表。该菌在海水育苗和养殖中易引起疾病,给生产造成较为严重的损失。目前,国内对该菌的研究以虾蟹类幼体的疾病为主。由于该菌的附着缠绕,使得虾蟹类幼体活动不便,呼吸和摄食受阻,导致生理机能下降和其它并发感染的发生,引起幼体大量死亡。条斑紫菜丝状细菌附着症是毛霉亮发菌附着在紫菜叶状体表面而引起的病害。由于它形态似丝状,故习惯上称之为丝状细菌附着症。此症最早由片山等报道,片山等和藤田等确认其致病菌为毛霉亮发菌,并对该菌的微生物学、发生情况及环境条件进行了调查研究。马家海在我国江苏省条斑紫菜栽培海区观察到叶状体上有丝状细菌附着,此种病害在我国条斑紫菜栽培海区较为常见,但至今尚未开展深入的研究。本文研究了该病的病症,并对其致病菌进行了初步的研究,旨在为今后此症的防治提供理论依据。1材料和方法1.1测定法海水淡化在江苏省南部一些发病严重的条斑紫菜栽培海区进行多次采样,将患病藻体用盐度26.9的消毒海水清洗干净,阴干,低温条件下带回实验室。取患病藻体进行镜检、摄像。1.2调查海岸带对江苏省南部沿海条斑紫菜栽培海区进行调查,了解发病情况及症状。1.3藻体的活化培养分离培养基使用Hoarld培养基。选取具有典型丝状细菌附着症症状的条斑紫菜叶状体,经无菌海水漂洗数次。漂洗后的藻体置于无菌海水中,用灭菌毛笔轻轻刷洗藻体表面,收集清洗液,稀释成不同浓度的菌液,涂布于分离培养基平板上。24h后镜检指纹状菌落,挑取并接种到另一平板,经多次划线纯化培养得到丝状细菌菌株YL。1.4实验条件与培养条件以分离获得的丝状细菌菌株YL对健康条斑紫菜叶状体进行感染试验。实验基本培养条件为:水温15℃,盐度为26.9,光照密度48.07~64.1μmol/(m2·s),光照周期14L∶10D,添加PES培养液充气培养,每天镜检、摄像。1.5形态观察将纯化的YL菌株分别接种于Hoarld固体和液体培养基,观察其生长情况及菌落特征,并进行革兰氏染色。1.6食物特性试验细菌营养特性试验参照文献进行。1.7通过不同的生态因素测定了菌株的生长1.7.1锥形瓶调节Harold液体培养基盐度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100,分装于25mL锥形瓶中。分别向不同盐度培养液中接种YL菌株,于25℃静置培养,48h后分别取样测定566nm处的OD值。1.7.2别为4、4.5、5.5、5.5、6.5、8.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5用无菌的1mol/LNaOH和HCl调节Harold液体培养基的pH分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11,分装于25mL锥形瓶中。分别向不同pH培养液中接种YL菌株,于25℃静置培养,48h后分别取样测定566nm处的OD值。1.7.3节培养温度接种YL菌株于Harold液体培养基中,调节培养温度(℃)分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45,静置培养48h后,分别取样测定566nm处的OD值。2结果2.1生长和附着网状细菌调查发现,该病的发病时间较长,从每年12月到翌年4月条斑紫菜生产中后期一直存在,通常随着生产日期的推移,病势越发加重。丝状细菌的附着一般多见于秋苗网紫菜达到5cm以上的藻体,发病严重时,1cm左右的紫菜叶状体上也可发现。有时,单孢子苗表面也大量附着丝状细菌,感染严重时可导致小苗死亡,条斑紫菜生产难以继续,给当年的紫菜栽培带来很大的影响。调查同时还发现,在浒苔、石莼、礁膜等绿藻上也有丝状细菌附着(图版Ⅰ-1)。大量附着丝状细菌的紫菜藻体,生长衰竭且色泽低落呈淡褐色或淡黄色,常伴有早熟现象。病斑开始呈绿色,后渐褪色。叶缘部分可见较多丝状细菌附着,再扩大至整个叶状体表面,而且数量逐渐增多。随着病势的发展,叶状体全体皱缩且从叶缘部开始溃腐。大量附着丝状细菌的藻体作为加工的原藻,光泽几乎完全丧失,以致加工后的干紫菜质量十分低下,严重地影响紫菜产品的品质,给生产造成了较为严重的损失。海区调查表明,丝状细菌的大量附着一般出现在生产的中后期,这一时期的海水温度大多在8~20℃之间,且呈逐渐上升的趋势。藻体患病的严重程度,一般低潮区重于中、高潮区;近岸的重于外海的;栽培密度大和海流缓慢的海区重于密度较稀、潮流较急的海区。2.2抗菌体的生长镜检发现,藻体的表面附着了大量的丝状细菌,特别是藻体的边缘较为明显(图版Ⅰ-2)。该菌菌丝体长度不一,一般为10μm~5mm,直径1~2μm。菌丝体无色、不分枝、不运动,无鞘,成熟的菌丝呈串珠状(图版Ⅰ-3),大量的丝状细菌往往会缠绕生长或形成缠结(图版Ⅰ-3),这与伯杰细菌鉴定手册上对毛霉亮发菌的形态描述相一致。丝状细菌的一端附着于藻体上,另一端向外生长。其基部可以进入细胞壁表层,但不穿透细胞壁进入细胞内部(图版Ⅰ-4)。丝状细菌大量附着的部位,藻体细胞的原生质收缩,进而瓦解死亡。大量的死细胞连成一片,患病部位碎烂,在海上很快随着潮流、波浪流失。微生子往往成簇附着在藻体边缘(图版Ⅰ-5,7),而后附着量逐渐增多,微生子也逐渐生长成为菌丝体(图版Ⅰ-6)。试验中还发现有菌丝体形成的玫瑰花环结构附着在藻体边缘(图版Ⅰ-8)。随着藻体表面附着丝状细菌数量的逐渐增加,藻体细胞逐渐萎缩死亡(图版Ⅰ-9~11),从而在藻体上出现病斑(图版Ⅰ-12)。2.3网状细菌感染法感染结果表明,分离纯化的YL菌株对健康条斑紫菜进行感染后,表现出典型的丝状细菌附着症的症状,与自然海区的病菜症状一致。感染的藻体呈淡褐色,病斑呈绿色,大量附着丝状细菌的部位腐烂呈黄白色。感染初期,藻体表面有少量丝状细菌附着,菌丝较短,呈簇出现,主要在藻体的边缘部位附着。随着感染的进行,丝状细菌生长旺盛,大量的丝状细菌密集生长,整株藻体均有菌丝体附着,病情进一步发展,附着部位的细胞逐渐死亡解体,形成绿色的病斑,而后逐渐褪色溃烂,在藻体上形成孔洞。在感染试验中还观察到,大量附生丝状细菌的藻体常伴有早熟现象。感染后期的藻体上大量组织脱落,患病严重的藻体甚至已经泛白死亡。附着于藻体表面的丝状细菌为无色、不分枝的丝状体,有些菌丝呈串珠状。菌丝的一端附着于藻体表面,另一端游离于海水中。观察发现,菌丝的基部可以进入细胞壁的表层,但是不穿透细胞壁。这与自然海区患病藻体上附着的丝状细菌形态一致。从感染后发病的藻体上再次分离到与YL菌株相同的丝状细菌。2.4丝绸细菌的生长特征2.4.1微肝胰腺组织的生长YL菌株在Hoarld固体培养基形成肉眼可见的半透明菌落,菌落无固定形状。镜检发现,散落在固体培养基上的微生子不断生长、弯曲在平板上逐渐形成指纹形状(图版Ⅱ-1,2)。而后,菌丝体继续生长缠绕,并向顶部堆叠,逐渐隆起形成菌落(图版Ⅱ-3,4)。一般接种后14~16h可形成指纹状结构,48h内可以形成隆起形菌落。2.4.2液体培养基的微肝电泳将YL菌株接种于Hoarld液体培养基中振荡培养,36h后发现液体变浑浊。在显微镜下可见许多微生子。微生子在液体中可相互靠近,聚集在一起形成玫瑰花环结构(图版Ⅲ-1,2),这是毛霉亮发菌在液体培养中最显著的特征。形成玫瑰花环结构的微生子为3~12个。微生子在形成的玫瑰花环结构中可以继续生长,2~3d后可变长形成菌丝。液体培养基中还可见单根菌丝体存在。菌丝体成熟时可在顶端、中部断裂形成微生子(图版Ⅲ-3,4)进行增殖。菌丝体在液体培养基中可以形成独特的绳结状结构。在培养基中,单根菌丝两端相交,菌丝一端从上方越过另一端,形成1个绳结状结构(图版Ⅲ-5,箭头所指为绳结状结构)。两根菌丝体也可以相互缠绕形成绳结状结构(图版Ⅲ-6,箭头所指为绳结状结构)。2.5糖液酶菌剂试验结果显示,该菌为需氧革兰氏阴性菌。该菌不能水解淀粉,接触酶试验为阳性,能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖;不能利用琼脂、乳糖、作为碳源。2.5.1yl菌株最适盐度及盐度对菌株生长的影响试验结果表明(图1),YL菌株在盐度为0的情况下不能生长。YL菌株在盐度为5~100之间均能生长,其最适盐度为25~35。盐度超过60后,虽然菌株仍可生长,但生长速度迅速下降。2.5.2在不同的ph值下，丝状细菌的生长试验由图2可见,YL菌株适宜生长的pH范围为5.0~10.0,最适宜生长的范围为7.0~8.0,其中pH为8时生长最为旺盛。2.5.3不同温度下的丝状细菌生长试验由图3可以看出,YL菌株的最适生长温度为10~25℃,尤其在15℃生长最旺盛。3讨论3.1认定菌体形态特征YL菌株为无色丝状体,无鞘、无鞭毛,在固体培养基中可形成指纹状菌落,在液体培养基中可形成玫瑰花环结构和绳结状结构。初步判断此菌株为毛霉亮发菌(Leucothrixmucor)。该菌有独特的形态特征,从而使毛霉亮发菌的形态学鉴别成为可能。Brock首次发现报道毛霉亮发菌形成独特的绳结状结构(knot)。该菌的菌丝在液体培养基中长到一定程度后,单根菌丝首末端相互缠绕或几根菌丝体相互缠绕形成独特绳结状结构。Brock认为绳结状结构是由于菌丝体两侧生长速度不相等,从而使菌体发生弯曲,继而形成绳结状结构,此结构在其他丝状细菌中并未发现。本文还发现不仅单根菌丝体可以形成绳结状结构,两根菌丝体也可形成绳结状结构。3.2藻体表面的附着特性研究表明毛霉亮发菌除可以附着于底栖甲壳类、无脊椎动物以及虾蟹类的卵和鱼卵表面外,还可以附着于大型海藻表面,但其致病机制不同。万夕和等对中华绒螯蟹幼体丝状细菌病的研究指出,丝状细菌虽然附生在幼体的体表,并未对幼体产生直接的侵蚀或病理性损害,但会使其活动摄食受阻引起死亡。Bland等研究发现,毛霉亮发菌可附着在聚丙烯等无机物的表面,但附着的数量及长度都要小于有机物为宿主时的数量和长度,并推测这是由于海水中的碳源不能满足毛霉亮发菌生长所致。研究还表明同等条件下毛霉亮发菌更倾向于将藻体作为宿主。大型海藻可以为毛霉亮发菌的生长提供碳源等营养物质,这是毛霉亮发菌成为紫菜丝状细菌附着症致病菌的前提条件之一。其次,毛霉亮发菌在不同藻类表面的附着情况也存在一定差异。Johnson等对马绍尔群岛藻类的观察表明可附着毛霉亮发菌的红藻种类多于绿藻、褐藻和蓝绿藻的种类。Bland等指出,在不同的藻类体表,毛霉亮发菌的数量不同,红藻门藻类附着的毛霉亮发菌数目比其他藻类高出20~30倍。此外,本文还观察到菌丝体并未穿透细胞壁进入细胞内部,菌丝体生长所需的碳源等营养物质可能来自细胞壁和藻胶层。菌体营养试验表明该菌可以利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖等作为其唯一碳源。而不同细胞壁组成成分的不同可能是其附着差异的原因之一;Bland还认为某些藻类所产生的胞外抑菌物质也可能是造成附着差异的原因之一。本试验中还发现丝状细菌附着的藻体还有其它病害同时发生的情况。这可能是由于丝状细菌破坏了其细胞壁结构,从而导致藻体抗病性减弱所致。另外,杨锐等对条斑紫菜外生细菌的遗传多样性研究后指出,藻际微环境(phycosphere)的平衡与否是引起条斑紫菜病害的原因,大量附着极有可能使藻体的原有藻际微环境的平衡发生改变,继而引起致病菌数量增多,导致藻体发生病变。试验中还发现微生子与已形成附着基(holdfast)的毛霉亮发菌都可以附着在紫菜叶状体的表面。Brock观察玫瑰花环结构时发现微生子在相互聚集形成早期的玫瑰花环结构后会逐渐生成附着基。本试验中也观察到了此现象,且在感染早期,微生子与菌丝体往往成簇出现。这是否与形成附着基有关还需进一步研究。到目前为止,仍未有对其附着基构成的详细报道。它以何种机理附着在机体表面,有待进一步试验。3.3抗菌材料型的城市紫菜栽培中出现的一些目前国内外对紫菜病害的报道表明,无论是寄生性微生物引起的病害或是不良环境引起的生理性病害,都与海洋环境中的各种生态因子密切相关。马家海指出,高水温、风平浪静、潮流不畅、低比重等因素是助长病害发生与发展的条件。杨锐等认为紫菜外生菌组成与其生活环境密切相关。同时,人为因素如筏架网帘设置过多过密等,也是造成病害频发的原因之一。近年来,由于我国紫菜栽培业的快速发展,海区栽培密度过大,导致每年都爆发不同程度的病害。关于上述各种因素对丝状细菌附着的影响国内尚未有报道。本文通过海区调查发现,丝状细菌附着症自12月份开始,伴随紫菜栽培中后期,直至4月份末条斑紫菜采收结束为止。此病与拟油壶菌病、赤腐病等严重