树突状细胞对细胞il-10和gf-

树突状细胞对细胞il-10和gf-

c型肿瘤的来源、形态和功能具有明显的多样性和异质性，不仅能诱导t细胞的激活，而且在诱导中肠炎和外围抵抗方面也发挥着非常重要的作用。DC的不同成熟状态有着不同的功能。DC的成熟状态不仅决定T细胞的激活程度,而且还决定T细胞的反应类型。未成熟DC可诱导T细胞无能或调节性T细胞的产生,从而诱导免疫耐受。本研究旨在探讨未成熟DC对T细胞功能的影响及其可能机制。1材料和方法1.1细胞因子和tgf-1的分子RPMI-1640培养基、胎牛血清、逆转录试剂盒、TRIZOL为美国Gibco公司产品。PCRMarker购自大连宝生物公司。细胞因子rrIL-2、rrIL-4、rrGM-CSF均为Sigma公司产品。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自SantaCruz公司。乙酰胆碱受体(AChR)由本实验室提取。健康雄性Lewis大鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.2ova负载的dc按本实验室已有方法培养DC。收集疏松黏附于培养板底的DC,第6天加入LPS的同时,未成熟组和成熟组分别加入50μg/ml的AChR或50μg/ml的OVA,置37℃、5%的CO2孵箱中,用完全培养基继续培养18h即得AChR负载的iDC(AChR+iDC)、AChR负载的mDC(AChR+mDC)和OVA负载的mDC(OVA+mDC)。充分洗涤后重悬于RPMI-1640完全培养基,加入终质量浓度为25μg/ml的丝裂霉素C,于37℃孵育30min灭活后,以RPMI-1640培养液洗涤3次,调整细胞数为4×105/ml作为刺激细胞。1.3混合淋巴结反应1.3.1u3000不同浓度的il-2扩增t细胞尼龙毛柱法分离Lewis大鼠脾脏T细胞。取24孔培养板,每孔分别加入106T细胞,再加入105AChR负载的iDC或mDC刺激,用完全培养基调整终体积为1ml。置37℃、5%的CO2孵箱中培养。第6天加入终浓度为100U/ml的IL-2扩增T细胞。2周后,同前条件加入105AChR负载的iDC或mDC再次刺激。再次刺激后第3天加入终浓度为100U/ml的IL-2扩增T细胞。再次刺激1周后,同条件加入105AChR负载的iDC或mDC行第3次刺激。第3次刺激后第3天加入终浓度为100U/ml的IL-2扩增T细胞。1.3.2免疫活性测定取96孔培养板,每孔分别加入2×105AChR负载的DC重复刺激前的T细胞作反应细胞(NT);再分别加2×104、1×104、5×103AChR负载的iDC或mDC作刺激细胞,终体积为200μl;每浓度设3个复孔。37℃、5%CO2孵箱中培养。4d后每孔加入5mg/ml的MTT20μl,继续培养4h。离心弃上清,每孔加入DMSO100μl,测各孔490nm波长的光密度值(A490nm),结果以3孔均值表示。同前方法,反应细胞改为AChR负载的iDC或mDC重复刺激3次后的T细胞(iDC-3T或mDC-3T),测定其对AChR负载的iDC或mDC的增殖活性。同前方法,刺激细胞改为OVA负载的mDC,测定AChR负载的iDC或mDC重复刺激3次后的T细胞对OVA负载的mDC刺激的增殖活性。1.4基于-actin的生物合成工艺收集AChR负载的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重复刺激3次后的各组T细胞,用TRIZOL试剂提取细胞总RNA。在逆转录酶M-MLV的作用下,将mRNA逆转录成cDNA分子。然后通过PCR扩增IL-12p35和参照β-actin的cDNA。IL-10的上游引物为:5′-AGGGCTGCCTTCAGTC-3′,下游引物为:5′-TGGAGAGAGGTACAAACG-3′,扩增产物长度为499bp。β-actin的上游引物为:5′-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3′,下游引物为:5′-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3′,扩增产物长度为266bp。PCR总反应体积50μl。反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,48℃(β-actin为54℃)退火30s,72℃延伸45s,共进行32个循环,72℃加强延伸7min。将10μl扩增产物于琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察并摄像。1.5蛋白质电泳检测收集AChR负载的iDC或mDC初次刺激前、初次刺激后和重复刺激3次后的各组T细胞,提取蛋白质并在595nm波长下进行检测蛋白浓度。制备SDS凝胶后进行蛋白质电泳。在SDS凝胶上进行蛋白质的电转移并进行免疫检测。1.6比较方法:最小显著差数据以ue0af±s表示,多个实验组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),两两比较采用最小显著差(LSD)法。两组之间的比较采用t检验。以α=0.05为检验显著性水准。2结果2.1淋巴结移植的测定2.1.1t细胞增殖能力的检测AChR+mDC初次和重复刺激均能诱导强烈的T细胞增殖。而AChR+iDC初次和重复刺激均只引起较弱的T细胞增殖,重复刺激后T细胞增殖能力更低,见表1。2.1.2t细胞对acrt-mdc的增殖AChR+mDC重复刺激3个循环后的T细胞对AChR+iDC的刺激引起较弱的增殖反应,而AChR+iDC重复刺激3个循环后的T细胞对AChR+mDC的刺激不引起增殖。AChR+mDC和AChR+iDC重复刺激3个循环后的T细胞均能对无关抗原OVA负载的mDC的刺激产生明显增殖,前者增殖反应更强,见表2。2.2acrt-icp初次和第3次重复刺激il-10morna的表达5组T细胞β-actinmRNA表达恒定,无明显差异,表明该实验方法可靠,结果具有可比性。AChR+mDC初次和第3次重复刺激后,IL-10mRNA的表达较刺激前无明显变化,而AChR+iDC初次和第3次重复刺激后,IL-10mRNA的表达较刺激前均明显增高,见图1。2.3TGF-β1的表达AChR+mDC初次和第3次重复刺激后,TGF-β1的表达较刺激前无明显变化,而AChR+iDC初次和第3次重复刺激后,TGF-β1的表达均显著增高,重复刺激后TGF-β1的增高尤为明显,见图2。3调节性t细胞的诱导DC不仅可激活T细胞免疫,同时也可诱导中枢和外周耐受。DC提呈抗原最终表现为免疫激活还是免疫耐受的决定因素目前尚不十分清楚。一种观点认为,机体内存在不同的DC亚群,它们分别负责不同的功能,如髓样DC激活免疫反应而淋巴样DC则诱导免疫耐受。但近来研究表明,DC亚群的功能并非一成不变的,如从人的前体细胞分化而来的DC,对不同的活化刺激物表现出不同的反应,而大鼠未成熟髓样DC可诱导耐受。因此,这种一类细胞对应一类免疫反应的观念受到了挑战,并提出了另外一种观点:DC的不同成熟状态有着不同的功能。未成熟DC表面MHC、共刺激分子及其它辅助分子的表达水平较低,所以虽然它们具有很强的抗原摄取加工能力,但由于缺少第一和/或第二信号的刺激而不能活化T细胞,导致T细胞的无能或低反应性,从而诱导抗原特异性耐受。未成熟DC可诱导T细胞无能并显著延长移植物的存活时间。抗原负载的未成熟DC可诱导1型糖尿病耐受。体外实验发现,未成熟DC可诱导抗原特异性T细胞无能。受者T细胞与供者未成熟DC共同培养后,当再用供者免疫源性DC刺激时,细胞因子的分泌明显减少且T细胞呈现明显的低反应性。本研究中,AChR负载的mDC初次和重复刺激均能诱导强烈的T细胞增殖,而AChR负载的iDC初次和重复刺激均只引起微弱的T细胞增殖;当这些经AChR负载的iDC重复刺激3个循环后的T细胞再用AChR负载的mDC刺激时,也不能引起T细胞增殖;但当用无关抗原OVA负载的mDC刺激时,则产生明显的增殖反应。提示未成熟DC可引起T细胞耐受,且这种耐受是抗原AChR特异性的。调节性T细胞是机体内具有特殊表面标志和细胞因子分泌模式并具有调节功能的一个T细胞群体,其抑制功能在外周耐受的维持中具有十分重要的作用。调节性T-1(Tr1)细胞不同于Th1/Th2细胞,它们产生大量的IL-10、中量的TGF-β、少量的IL-2但无IL-4。Tr1受到刺激后增殖能力很弱,但在体内外均具有免疫抑制功能,这种免疫抑制功能主要通过细胞因子IL-10和TGF-β而发挥,细胞间的直接接触也起重要作用。调节性T细胞的产生与DC的成熟状态密切相关,人类未成熟DC在体内外均可通过诱导具有调节能力的非增殖性Tr样细胞的分化引起外周耐