流式细胞术检测细胞因子的研究进展

流式细胞术检测细胞因子的研究进展

主要活性物质和环境反应的主要指南和调节。正常情况下,细胞因子的表达和分泌受到严格的调控,病理状态下会出现异常表达,故检测细胞因子对于疾病的诊断、治疗具有重要意义。细胞因子免疫学检测方法基本原理是将细胞因子作为抗原,用针对该抗原的特异性抗体进行定量或定性的检测。既往检测技术主要采用ELISA法,由于细胞因子半衰期不同,其检测结果的准确性降低。酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)检测的是分泌细胞因子的细胞数量,不受细胞因子代谢的影响,能比较真实反应体内细胞因子水平,已得到广泛研究并应用到临床结核感染的诊断中。流式细胞术(flowcytometry,FCM)能明确产生细胞因子的细胞数量,不仅可同时检测几种细胞因子,还可确定产生细胞因子的细胞亚型,是一种相对快速并能准确定量的检测细胞因子的方法。一、fcm检测细胞因子的方法FCM是20世纪70年代发展起来的一种对液流中排成单列的细胞或其他生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术,可测定细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等多种参数,也可分类收集特定的细胞或细胞器,临床上广泛应用于感染性疾病、血液系统疾病、肿瘤学等多个学科。FCM检测ICK的方法是运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗和抗细胞因子单抗,检测单个细胞内多个细胞因子,可区分表达特定细胞因子的细胞亚群,不仅能了解细胞因子的量和产生细胞因子的细胞类型,还能了解细胞内细胞因子产生的动力学。FCM检测ICK技术主要是通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内免疫荧光染色,并结合膜表面抗原染色,用多色FCM分析各种细胞内合成的细胞因子,并对免疫细胞进行分类,如辅助性T细胞(Th1、Th2)等,为疾病的早期诊断和治疗提供重要依据。方法是通过体外多克隆激活剂激活细胞,同时以阻断剂阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运,抑制细胞因子释放到细胞外,使产生的细胞因子在细胞质内蓄积,使其信号增强。经细胞膜固定和破膜剂增加细胞的通透性后,用抗细胞因子的抗体与细胞内特定的分子相结合,通过非相关特异性同型匹配的抗体作为对照,确定静止的与无细胞因子分泌的细胞的最小荧光背景,既可用FCM检测不同的细胞亚群分泌的ICK。二、在其他领域的研究和应用FCM技术在肿瘤疫苗、HIV感染、自身免疫病等领域已得到较为广泛的研究和应用。近年来,FCK检测ICK技术在结核感染的诊断及治疗疗效评价等方面也进行了较为深入的研究并取得一定进展。1.mdna的耐药基因检测结核菌素试验是检测结核分枝杆菌感染的传统检测手段,但其与卡介菌和环境分枝杆菌存在交叉反应,其特异性较差。由于IFN-γ是细胞免疫介导的最为关键的细胞因子,因此应用结核特异性抗原检测特异性T淋巴细胞合成或分泌IFN-γ的浓度或效应T淋巴细胞的数量可以判断机体是否感染结核分枝杆菌。Cosmi等应用FCM细胞内细胞因子染色技术对活动性结核、隐性结核感染、卡介苗接种者和健康志愿者的全血标本,应用结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)和早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)作为抗原,检测CD4+T细胞的表达,结果提示,活动性结核、结核潜伏感染患者的PPD特异性T淋巴细胞比例较BCG接种的志愿者明显升高。抗原培育后,活动性结核、结核潜伏感染患者较未接种卡介苗及接种卡介苗的健康志愿者CD4+CD69+IFN-γT细胞明显升高,而在未接种卡介苗与接种卡介苗的健康志愿者中ESAT-6特异性淋巴细胞未见明显区别。提示应用流式技术,ESAT-6作为抗原可鉴别出结核潜伏感染与健康志愿者和BCG接种者。同时,还可鉴别出TST阴性的结核和非结核分枝杆菌感染。提示流式胞内细胞因子检测技术较TST在诊断结核感染方面有更高的阳性预测值。研究证实,采用多色免疫荧光和胞内细胞因子的染色技术,以ESAT-6作为抗原,检测抗原特异性CD4+T淋巴细胞,均得到较高的阳性率,提示此方法可作为结核感染的一种诊断手段。2.细胞因子检测在细胞因子的多项检测研究中,应用不同的抗原及不同的培养时间,有时会得到迥异的结果。Antas等应用流式细胞术对结核患者细胞因子产生的动力学进行了研究,以PPD作为抗原,测定结核患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)抗原特异性T淋巴细胞的表达并对不同时间段(8、12、16、20及24h)细胞因子的产生进行了动态观察,结果显示,IFN-γ产生的峰值时间为16h,IL-4产生的峰值时间为24h。培养后用流式方法很快就可检测出细胞因子,而上清中细胞因子浓度需在培养后24h方可检出。因为培养上清中的细胞因子的水平代表的是分泌的细胞因子数量,它受细胞因子合成、转运、在高尔基体的聚集及分泌几种参数的影响,而胞内细胞因子的检测只受细胞因子合成的影响,因此,FCM检测ICK技术是一种更可靠且重复性好的检测细胞因子的方法。3.抗结核治疗后细胞中ifn-的表达为了明确结核患者治疗前后细胞因子的动态变化,Veenstra等对结核患者外周全血经抗CD3单克隆抗体刺激后进行检测,CD4+、CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ的细胞比例最高达13%,较非结核患者有明显升高,而抗结核治疗1周后,产生IFN-γ的细胞比例有所下降,治疗26周时,IFN-γ产生细胞的比例降至正常水平。结果显示,抗结核治疗后随着结核病变的好转,体内的结核分枝杆菌减少,抗原刺激减弱,抗原特异性T淋巴细胞随之减少。因此,考虑FCM检测治疗前后细胞因子的动态变化可对患者的治疗疗效有提示作用。4.结核性胸液的免疫检测胸腔积液中的单个核细胞(pleuraleffusionmononuclearcells,PEMC)数量显著高于PBMC数量,甚至可以达到PBMC的15倍,故理论上认为对感染局部进行抗原特异性T淋巴细胞的检测有可能获得更高的敏感性,因此,结核性胸液的各项免疫学指标较全血更有意义。Lee等应用流式技术检测抗原特异性细胞因子诊断结核性胸腔积液的敏感性为91%。杜凤娇等应用流式细胞术检测结核性胸水中PEMC经ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激后抗原特异性TH1百分比诊断结核性胸水的敏感性为87.5%,特异度为90.0%。与同时进行的ELISPOT技术检测的诊断敏感性和特异性水平相当。因此,应用流式技术检测抗原特异性细胞因子可用于结核性胸膜炎的诊断中,尤其对相关检查结果不特异的患者可提供重要帮助。5.细胞因子的检测李丽等对结核性胸腔积液PEMC检测ESAT-6抗原刺激后,依据CD4+T细胞分泌TH1型细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的不同组合,其中TNF-α单阳性细胞的比例最高,其次为Th1细胞(IFN-γ+TNF-α+IL-2+),即胸液中存在相当比例的Th1细胞,其不仅分泌细胞因子种类最多,且分泌细胞因子的量也明显高于其他亚群,因此很可能在局部结核控制中发挥重要的保护效应。Qiao等应用EAST-6和CFP-10作为抗原,检测刺激结核性胸液中PEMCIFN-γ、IL-17和IL-22,结果显示,IFN-γ、IL-17均得到高表达,以IFN-γ高表达占明显优势。因流式方法可同时检测几种细胞因子,因此,在对细胞因子功能检测方面有重要作用。胥萍等研究发现,初治肺结核患者外周血中CD4+IFN-γ+水平均显著低于健康对照组,CD4+IL-4+水平则显著高于健康对照组。粟粒性肺结核患者外周血中Thl细胞含量显著低于继发性肺结核患者,Th2水平显著高于继发性性肺结核和结核性胸膜炎。CD4+/CD3+T比例在3种结核病程中均呈下降趋势,且粟粒性肺结核显著低于继发性肺结核。提示不同类型结核病患者均存在不同程度的免疫功能减低,对Th1、Th2水平与CD4+/CD3+测定可助于临床病情的判断和疗效观察。6.cd27通过了pd-pcr和cfp-10在耐药理关于结核感染的诊断目前已有较为公认的诊断指标,如T-SPOT-TB方法,但活动性结核病与结核感染目前尚无明确的鉴别诊断指标。研究显示,活动性结核患者IFN-γ+CD4+T细胞多为CD27-细胞,提示在活动性结核病中,CD27-细胞可能为活动性结核病的诊断提供帮助。一项大鼠肺结核模型的实验对此也做了进一步验证,提示CD27可能为活动性结核和结核感染或非结核患者的鉴别提供帮助。Sargentini等以PPD和ESAT-6/CFP-10作为抗原,应用流式技术检测活动性结核病、结核潜伏感染和健康志愿者PBMC抗原刺激后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17,结果显示,潜伏结核感染患者的IL-2分泌较活动性结核患者升高有统计学意