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文档简介

核酸固相杂交方法将参加反应的一条核酸链（待测链）先固定在固体支持物上，一条反应核酸（探针）游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以最为常用。液相杂交

所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。斑点印迹杂交杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形则称为狭缝杂交。实验原理优点

斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交来说快，这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品适合于同时分析多个样品。实验步骤：变性：按8:1将80ulddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀释样品。100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul20×SSC混匀。点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42℃恒温床上，轻轻振荡1-2h。变性DNA与探针结合5洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到42℃），每次5min；再将洗液2(每次5ml）洗膜两次（预热到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高6封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点7酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入3ml亲和素-辣根过氧化物酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合8洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入5ml洗液3，洗膜三次，每次2-3min。洗去未结合的酶联抗体9

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