补肾中药对肾阳虚小鼠肾上腺细胞形态学的影响

补肾中药对肾阳虚小鼠肾上腺细胞形态学的影响

1数据和方法1.1材料表面1.1.1动物45只健康雄性大鼠，体重35.40g。180只大鼠，体重为28.35g，由苏州大学实验动物中心提供。1.1.2戊酸成虫二醇金匱肾气丸由济南宏济堂制药有限责任公司生产,批号为20030312。戊酸雌二醇由法国ScheringS.A公司生产,批号为037B-2。戊二醛由上海化学试剂采购供应站供应,批号为841002。1.1.3主要设备电子天平(JA1003型,上海天平仪器厂),显微镜(AO,美国),透射电子显微镜(JEOL、JEM-l200EX型,日本)。1.2方法1.2.1实验动物及分组动情期雌鼠的准备:雌鼠每天灌胃戊酸雌二醇混悬液0.5mL(含药0.00468mg),以阴道涂片检查角化细胞证实之。雄鼠的筛选:将每只雄鼠与两只动情期雌鼠共笼,次日取出雌鼠有阴道栓笼中的雄鼠为实验用雄鼠。实验分组:实验用雄鼠45只,随机分为3组,每组15只。正常组:常规饲养,每天灌胃蒸馏水0.5mL/只。劳倦过度+房室不节组(模型组):每天上午8:00在水深25cm、水温25℃、容积5000mL的圆型玻璃缸内强迫小鼠游泳至无力而下沉时捞出,造成劳倦过度;每只雄鼠与6只动情期雌鼠同笼,注意每天更换动情期雌鼠以诱导房室不节,每天灌胃蒸馏水0.5mL/只。金匱肾气丸治疗组(治疗组):造模方法同劳倦过度+房室不节组,每天灌胃金匱肾气丸混悬液0.5mL/只(含药0.0842g)。1.2.2肾上腺器官系数的测定实验4周后,称动物体质量,颈椎脱臼处死,迅速摘取肾上腺并称重,计算其脏器系数。肾上腺系数=肾上腺重(g)/体质量(g)×100%。1.2.3形态学改变将上述摘除的一侧肾上腺用10%福尔马林固定,按常规方法制作石蜡切片,光镜下观察形态学改变。再取小鼠另一侧肾上腺,用2.5%的戊二醛固定,1%锇酸后固定,常规脱水、包埋,包埋后的样品块先制成半薄切片,在光镜下定位,选取相同的部位制作电镜切片,电镜下观察肾上腺超微结构。1.3统计处理用SPSS10.0软件包进行数据处理,所得计量资料用表示,组间比较用单因素方差分析,P﹤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1失去光泽,公司与正常组相比,模型组小鼠自主活动明显减少,倦怠,精神萎靡,弓背,踡缩,拥挤在一起,体毛枯疏、失去光泽,采食量、饮水量减少,游泳时间缩短,耐寒能力明显下降,大便变稀,尿量增多,腹部皮毛潮湿,阴囊皱缩,睾丸回升,舌色淡白,舌体胖嫩,舌边有齿痕。与模型组相比,治疗组小鼠自主活动次数明显增加,游泳时间延长,耐寒能力明显提高,与雌鼠同笼时可见阴道栓,舌色淡白,舌边齿痕不明显。2.2各组小鼠肝肾系数的比较见表1。模型组较正常组小鼠肾上腺质量显著下降(P﹤0.01),治疗组小鼠肾上腺质量较模型组有上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);模型组肾上腺系数比正常组小鼠明显下降(P﹤0.05),治疗组肾上腺系数虽较模型组有一定程度的提高,但差异无统计学意义(P>0.05)。说明金匱肾气丸对肾阳虚小鼠肾上腺有一定的改善作用。2.3各组细胞结构的比较正常组:光镜下可见,肾上腺分为皮质、髓质,皮质较厚,皮质可明确区分球状带、束状带、网状带。球状带、束状带细胞结构清晰,排列规则,见图1A、B。模型组:肾上腺皮质变薄,肾上腺皮质球状带、束状带变窄、结构不清。细胞排列不规则,细胞体积缩小、染色变浅,细胞质呈空泡状,细胞间隙变宽,见图2A、B。治疗组:肾上腺皮质较厚,束状带占整个皮质的比例与正常组相近,细胞排列有序,形态接近于正常组,见图3A、B。2.4肝肾皮质束状带结构正常组:肾上腺皮质束状带细胞核圆形或椭圆形,核膜平滑,染色质分布均匀;线粒体数量多而密集,管状嵴清晰;脂滴多,数量多。部分细胞有较多的粗面内质网,断面呈短管状,核糖体排列整齐,游离核糖体较多,见图4A。模型组:肾上腺皮质束状带细胞核形状不规则、变形,有的核周间隙局部扩大,核膜受损不清晰,外层核膜突向胞质,染色质团块状;线粒体的数量比正常组显著减少,部分线粒体明显肿胀、变性,同心圆或指纹状嵴;脂滴多,但大小不等,形状不整;粗面内质网较正常组少;滑面内质网显著扩张,呈小泡状,见图4B。治疗组:肾上腺皮质束状带细胞虽有部分核形状不规则,但基本恢复正常,核圆,核膜正常;线粒体数量有所增加,部分仍肿胀,但肿胀程度减轻,管状嵴;脂滴的上述改变基本消失;滑面内质网增多,但仍扩张;粗面内质网明显增多,呈较长的短管状;游离核糖体丰富,见图4C。3金肾丸治疗肾阳虚的机制本研究前期利用放射免疫法检测了肾阳虚小鼠脑组织促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、血浆ACTH、皮质醇(Cor.)含量,利用酶联免疫法检测了肾阳虚小鼠血浆皮质酮、肾上腺素含量,结果表明,“劳倦过度、房室不节”可以导致小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴激素CRH、ACTH、Cor.、皮质酮、肾上腺素含量降低,金匱肾气丸治疗可以逆转这种变化。本研究结果表明,肾阳虚小鼠肾上腺系数、肾上腺组织形态及超微结构均较正常组发生改变,表明“劳倦过度、房室不节”可致肾阳虚损,温煦功能失职,不能蒸化肾阴化生精气,导致肾阳虚小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱,肾上腺组织形态及超微结构被破坏。补肾中药金匱肾气丸能够通过提高下丘脑-垂体-肾上腺轴激素水平、改善肾上腺形态结构,而最终能够从结构到功能调整机体的阴阳失衡,改善肾阳虚症状。这可能是其治疗肾阳虚的作用机制之一。肾为先天之本,生命之根,肾阳对机体各器官起着温煦和生化作用,肾阳虚则引起各种衰退症状。近年研究发现,肾与下丘脑-垂体-肾上腺的功能密切相关,肾阳虚证具有不同程度的下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能低下,温补肾阳能有效改善下丘脑-垂体-肾上腺的功能。金匱肾气丸为中医经典补肾壮阳方药,主要由熟地黄、肉桂、附子、泽泻、茯苓、山茱萸、牡丹皮、牛膝等多味药组成,有温补肾阳、化气利水、消肿止渴、纳气固本等功效,临床上多用于治疗肾阳虚型的多种疾病。本研究主要观察该方对肾阳虚小鼠肾上腺细胞形态学的影响,从而初步阐明金匱肾气丸治疗肾阳虚的作用机理,为临床治疗肾阳虚证提供实验依据。肾阳是人体生命活动的原动力,为人体生命之根本,被视为生命的象征。现代医家对肾阳虚的研究表明,肾阳虚的出现标志着机体各种功能处于低下状态,广泛涉及神经系统、内分泌系统、免疫学和基础代谢等方面,得出肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能紊乱的结论,并累及性腺轴、甲状腺轴,且在肾阳虚患者尸解中见到垂体前叶、肾上腺皮质形态学上发生退行性改变。动物实验结果表明,肾阳虚大鼠垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞存在着内质网扩张、线粒体肿胀、空化等超微结构损伤。ACTH细胞中内质网是合成ACTH的场所,线粒体是细胞进行氧化磷酸化、产生能量的场所。因此,这些超微结构的损伤,使