吉林省羊传染性脓疱病血清学检测与分析

吉林省羊传染性脓疱病血清学检测与分析

绵羊感染通常被称为“羊口伤口”。它是由羊感染的病毒（或f.v）引起的。绵羊、山羊和其他中小型反刍动物以及人类的急性和高度接触的动物共同感染的。ORFV为痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)成员,主要侵害3～6月龄羔羊,引起感染皮肤部位和黏膜的增生性病变,临床上以在感染动物的唇、鼻孔周围、口腔、乳房以及尾根等部位皮肤/黏膜形成红斑、丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征。该病自1787年首次发生于英国以来,澳大利亚、新西兰、南非、意大利、印度等多个养羊国家和地区均有报道。我国最早有关该病的文献记载是廖延雄等1955年撰写的西北绵羊“口疮”之初步报告。自此以后,新疆、西藏、甘肃、内蒙、陕西、四川、云南、福建以及东北三省等多个养羊省区均有该病发生和流行的报道。近年来,世界各养羊国家和地区有关ORFV感染的临床病例报道不断增多,其感染的宿主范围也在逐渐扩大,除绵羊、山羊等中小反刍动物外,也不断有麝牛、驯鹿、松鼠、海豹等多种野生动物以及人发生感染的报道。此外,该病毒可通过直接接触感染人类,严重威胁人类的身体健康,成为影响我国乃至全世界公共卫生安全的一个重要隐患,具有深远的公共卫生意义。针对该病在我国发生的严峻形势,本试验通过PCR和ELISA方法分别对病毒核酸以及血清抗体进行检测,调查其在吉林省羊群中的感染分布情况,初步阐明其流行规律。这不仅为研究病毒的分子致病机制奠定基础,而且将为针对感染现状日益严重的羊传染性脓疱病科学防控措施的制定提供重要的理论依据。1pcr检测和血清界定1.1材料628份痂皮组织样本采集自2006-2010年吉林省农安、九台、辽源、通化、延边、松原、白城、四平、大安等9个市县85个养羊户不同年龄不同品种疑似羊传染性脓疱病毒感染羊只;2160份血清样本随机采集自上述地区同期的85个发病羊群;采集组织和血清样本均置于-20℃保存。1.2试剂MiniBEST病毒DNA提取试剂盒、rTaqDNA聚合酶、dNTP、DNADL2000Marker等均购自大连TaKaRa公司;GST-CBP融合蛋白由本实验室制备保存;ORFV阳性羊血清由本实验室分离保存。1.3引物根据GenBank公布发表的ORFV干扰素抗性蛋白(Interferonresistanceprotein,VIR)基因序列,用PrimerPremier5.0软件设计目的片段扩增引物,引物由上海生物工程有限公司合成。依据VIR基因设计的引物序列如下:P15′-TTGCTGCGAGGACGGAAACCCG-3′;P25′-TGCAGGTGAAGCGCGGACAGTG-3′,预期扩增目的片段大小为284bp。1.4DNA提取及PCR检测用MiniBEST病毒DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA,操作按试剂盒说明书进行。以提取的病毒基因组DNA为模板,采用25μL的PCR反应体系,PCR扩增目的基因片段。PCR体系为:10×PCRBuffer2.5μL,2.5mmol/LdNTP1.5μL,rTaq酶0.5μL,25mmol/LP1、P2各1μL,模板5μL,灭菌蒸馏水13.5μL。反应条件为:95℃预变性2min30s;94℃30s,55℃30s,72℃40s,35个循环;72℃延伸10min。PCR扩增结束后,经2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.5血清学检测本实验室以大肠杆菌BL21(DE3)大肠杆菌表达的ORFVGST-CBP融合蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立了用于ORFV抗体检测的间接ELISA方法。用上述建立的间接ELISA方法对临床收集的血清样品进行检测,将待检血清样本按1∶40进行稀释,100μL/孔,每个血清样本设2个重复孔,同时设有ORFV阳性血清、阴性血清以及空白对照孔。ELISA测定结束后,通过酶标仪读其在490nm处的D值,所得数据以x¯±sx¯±s表示,并进行统计学分析(t检验)。2结果2.1扩增特异性基因片段PCR检测应用PCR方法从采集自吉林省农安、九台、松原、白城等9个市县的153份痂皮组织样品中均扩增到特异性的基因片段,大小约284bp,与预期结果一致(图1);羊群感染的平均阳性率为56.47%(48/85),痂皮组织样本的平均阳性率为24.36%(153/628),各地区ORFV阳性率从16.42%～32.60%不等,其中松原、白城地区的阳性率较高(表1)。2.2成年羊不同性别羊羊的检出率羔羊和育肥羊的ORFV抗原检出率较高,分别为30.27%(56/185)和31.34%(68/217);在成年羊,公羊的检出率最低,为6.94%(5/72);母羊的抗原阳性率稍高于公羊,为15.58%(24/154)(表2)。2.3羊及蒙古羊等抗寒羊品种的阳性检出情况对采自不同品种羊的痂皮样本进行PCR检测分析,结果显示:小尾寒羊、东北细毛羊及蒙古羊等绵羊品种的阳性检出率高于波尔山羊、辽宁绒山羊以及黑山羊等山羊品种,在绵羊品种中,小尾寒羊的阳性检出率最高,为31.07%(32/103);辽宁绒山羊在山羊品种中的检出率最高,为23.93%(28/117)(表3)。2.4血清抗体检测ORFV抗体阳性率通过间接ELISA方法对采集自吉林省农安、九台、松原、白城等9个市县85个羊群的2160份血清样本进行血清抗体检测发现,所有被检羊群中均存在有ORFV感染,ORFV抗体平均阳性率为39.44%(852/2160),各地的抗体阳性率从18.95%～53.49%不等,其中松原、白城以及农安地区羊群中ORFV抗体阳性率较高(表4)。2.5党员质量分数造林密度羔羊和育肥羊ORFV抗体阳性率较高,阳性率分别为50.21%(237/472)和57.17%(335/586);在成年羊,公羊的抗体阳性率为17.80%(94/528),母羊的抗体阳性率为32.40%(186/574)(表5)。2.6抗体阳性率对不同品种羊的血清学调查结果发现,绵羊ORFV感染的血清学阳性率明显高于山羊,其中东北细毛羊的抗体阳性率最高,为51.39%(221/432),在山羊品种中,辽宁绒山羊的抗体阳性率较高,为34.06%(156/458)(表6)。3不同地区和地区羊受感染的发生率及发生情况羊传染性脓疱病在世界各养羊国家和地区均有流行和发生,我国的十多个省份均有报道,其中以北方的养羊省份较为常见,目前该病已成为各养羊国家和地区羊群中常见的疫病之一。由于ORFV抵抗力强,羊群一旦被感染则不易被清除,可持续危害羊群多年。此外,近年来频繁的从国外引种、羊群饲养密度的加大以及粗放的饲养管理,导致羊群感染状况日益严重且常呈全群性发生,给养羊业造成巨大的经济损失。本试验应用PCR和间接ELISA方法分别对2006-2010年间采集自吉林省农安、九台、辽源、四平、松原、白城等9个市县85个羊群的628份痂皮样本和2160份血清样本进行ORFV核酸以及血清抗体检测,病原学检测结果显示,在各地区不同时期不同年龄段不同品种羊的皮肤痂皮样本中均可检测到ORFV,羊群中ORFV感染平均阳性率为24.36%(153/628),这表明ORFV在羊群中长期带毒,呈持续性流行状态。在不同年龄段的羊,以1～6月龄羔羊的抗原阳性率最高,表明ORFV主要侵害羔羊,而对成年羊的危害相对较小。在不同品种的羊,各品种羊的抗原阳性率不同,小尾寒羊、东北细毛羊及蒙古羊等绵羊品种的阳性检出率高于波尔山羊、辽宁绒山羊以及黑山羊等山羊品种,表明不同品种羊对ORFV的易感性不同,绵羊较山羊较为易感。血清学等调查结果显示,吉林省各县市的抗体阳性率从18.95%～53.49%不等,其中松原、白城和农安地区羊群中ORFV抗体阳性率较高。以上这些结果表明,ORFV在吉林省大部分地区羊群中的感染已经非常普遍,应该根据ORFV的感染现状有针对性地加强对该病的防控。通过对不同地区ORFV的感染率分析发现,不同县市的ORFV感染率存在一定的差别,其中吉林省北部的松原、白城等地区羊群的感染较为严重,这提示我们饲养环境与ORFV感染有很大关系,可以通过降低羊群的饲养密度、改善羊场的环境来降低ORFV感染的发生率。此外,对不同年龄段羊群的ORFV感染率分析发现,ORFV主要感染羔羊,尤其是断奶前后的羔羊,我们分析其原因:一方面可能是羔羊在吮乳过程中通过与感染的母羊接触而感染,另一方面是由于羔羊通过与病羊接触而传播,这提示我们ORFV的水平传播是一个重要的传播途径。因此,在引种时应进行严格的检疫,及时淘汰阳性种羊,加强对环境的消毒等是降低ORFV感染的重要途径。另外,在本次流行病学调查所涉及的85个羊群均未进行过羊传染性脓疱病毒疫苗接种,这可能是由于该病的死亡率较低而未引起养羊户的高度重视,造成羊群发生普遍感染。这个现象也提示我们,选择恰当的时间进行疫苗接种也能在一定程度上控制羊群中ORFV感染的发生。近年来,羊传染性脓疱病在世界各养羊国