TLR4 在脑出血继发性损伤中脑水肿形成的

TLR4在脑出血继发性损伤中脑水肿形成的炎性机制研究

一、实验背景及意义

二、实验研究内容

三、实验方法及技术

四、实验可行性分析

五、实验预期结果

六、实验进展

七、实验经费预算

八、参考文献实验背景及意义脑出血后继发性损伤脑水肿形成是多种机制的综合结果，其中炎性损伤机制备受瞩目[3,4]，各种炎性细胞的激活，细胞因子、炎性递质的释放，共同造成或加重继发性脑损伤[5]。研究说明炎性反响与脑水肿有着密切联系：炎性反响是脑水肿形成的重要原因[6,7]。目前在炎症免疫反响的研究领域里，Toll样受体家族〔Toll-likeReceptors,TLRs〕是众多学者的关注热点，其属于跨膜信号转导受体家族，通过感知病原微生物存在，转导细胞的炎性信号，参与多细胞生命体古老的防御机制，是连接先天免疫和特异性免疫的纽带。TLR4参与脑缺血再灌注损伤已被实验所证[16,17,18]，TLR4激活炎性反响是缺血性卒中后脑水肿形成的重要环节。Cao等[16]采用大鼠大脑中动脉线栓模型,研究发现脑缺血6h再灌注24h后,无论是脑水肿程度、脑梗死体积,还是神经元损伤程度,TLR4缺陷的小鼠都明显低于野生型,并且TNF-α和IL-6水平降低,认为脑缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通过抑制炎性细胞的激活,下调炎性细胞因子的产生来减少炎症反响,从而减轻损伤程度。其实脑出血后血肿周围也存在缺血现象[19]，出血性卒中与缺血性卒中的损伤机制在某种程度上有着共性。但TLR4是否参与脑出血后继发性损伤,是否通过介导炎性机制在脑水肿形成的病理生理演变过程中发挥作用,至今尚不清楚。水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是焦点，作为一种与水通透有关的细胞膜转运蛋白，影响水跨膜转运和调节细胞内外环境平衡。在正常脑组织中主要分布于邻近毛细血管壁的星形胶质细胞足突上和脑室周围的室管膜细胞，成为水在细胞、血管和脑室移动的关键部位[20]。星形胶质细胞瘤中AQP4表达明显上调,并与脑水肿程度、血脑屏障的开放有显著的相关性[21]。多种脑水肿实验模型均显示AQP4在脑水肿的发生开展中扮演重要角色[22，23]。实验说明：炎性反响可上调AQP4的表达。在过敏原和IL-13诱导的哮喘小鼠模型中[24],炎性反响显著，基底膜侧的AQP4表达上调是特征性的改变。AQP4在实验性自身免疫脑脊髓炎模型的脑皮质和脊髓中表达也上调[25],提示AQP4可能与急性期炎症的开展相关。张新宇等[26]通过在大鼠脑内微量注射炎性因子TNF-α后，发现早期就可出现脑水肿，并测得AQP4明显上调、血脑屏障通透性显著增加，且二者成显著正相关。因此，炎性因子诱发脑水肿的机制可能是：通过多种途径破坏血脑屏障，继而诱导AQP4表达上调，进一步加重脑水肿，形成恶性循环。进而推测：TLR4作为炎性信号通路转导受体，激活下游强有力的炎性级联反响，介导炎性损伤,极有可能也通过诱导AQP4表达上调,参与脑水肿形成。但目前，国内外缺乏此方面的研究。实验研究内容本课题采用大鼠尾状核立体定向注射自体血模型，研究TLR4是否通过介导炎性反响，上调AQP4表达参与脑出血后脑水肿形成，探索TLR4在脑出血继发性损伤中脑水肿形成的炎性机制。具体内容：1、从基因分子水平，研究时间演变过程中TLR4mRNA、TNF-αmRNA表达与AQP4mRNA表达、脑出血后脑水肿程度的相关性。2、并与蛋白、细胞水平结合，研究脑出血损伤后TLR4、TNF-α与AQP4在时空上的变化及联系。实验方法1、实验动物及分组实验一：65只SD大鼠将其随机分为手术组(A1组，n=30)、假手术组(B1组，n=30)、空白对照组(C1组，n=5)。A1组和B1组按手术后处死的时间再分为1h组、6h组、24h组、72h组，5d组，7d组，每组各为5只。在相应的时间点处死大鼠后测量大鼠脑的含水量、脑组织TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表达测定。实验技术2脑组织标本的采取:实验一：在各时间点将大鼠麻醉后断头取脑，以脑血肿处为界，将脑组织分为前半部、后半局部。前半部用于脑含水量的测定；后半部用于TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的测定。实验二：术后在相应时间点乙醚麻醉动物,从左心室插管至主动根部，生理盐水快速灌注之后，多聚甲醛快速灌注固定，断头取脑,以注射针道为中心做冠状切片,厚度约5mm.标本按常规程序制成厚度5μm的石蜡切片。相邻切片分别行HE染色病理观察、及TLR4、TNF-α、AQP4免疫组化检测实验技术3脑含水量的测定：取每只大鼠右侧大脑半球穿刺点前半部的脑组织分别称重(湿重)，然后置入100℃恒温烤箱中，24h后取出再称重(干重)。以(湿重－干重)／湿重×100％计算脑含水量，以此代表脑水肿的程度。实验技术4免疫组化法检测冠状脑切片TLR4、TNF-α、AQP4蛋白水平及对脑组织行RT-PCR分析TLR4、TNF-α、AQP4。实验可行性分析〔一〕承担单位概况(人员、资产、业务与管理状况)在相关国内外研究的根本动态和技术的根底上，我们具有一批能够参与该方面研究的人员。本课题组成员对相关学科的实验技术熟练，实验方法可靠，可重复性强，并已进行一些前期的研究，取得了初步经验。另外，申报单位具有国家重点实验室的平台，其实验设备与技术完全能满足该工程的需要。因此，探索脑出血继发性损伤机制，寻找炎性信号转导治疗靶点，我们认为从研究人员，到研究技术和研究条件都具有可行性。实验可行性分析〔二〕本工程现有的研究工作根底(包括现有科研装备条件)我院呼吸疾病国家重点实验室已具备了动物造模、RT-PCR、免疫组化等实验技术的所需设备：动物头颅立体定位仪(SN-2,NARISHIGE，日本)、电子分析天平(BP211D，塞多利斯，德国)、PCR热循环仪〔日本Techne公司〕、全自动紫外分光光度仪〔美国PerkinElmer公司〕、电泳凝胶图像分析仪〔上海Tanon公司〕、高速低温离心机〔德国Universal公司〕、电泳仪(PowerPacBasic,BIO一RAD，美国)、石蜡切片机(德国LeicaRM-2135)、光学显微镜(日本Olympus)、显微镜摄像系统(日本Olympus)等。该国家重点实验室及我院病理科可为实验提供有力的技术支持。实验预期结果1脑出血后TLR4作为炎性信号通路转导受体，激活下游强有力的炎性级联反响，通过诱导AQP4表达上调,参与脑水肿形成。2TNF-α通过诱导AQP4表达上调，参与脑出血后脑水肿的形成。实验进展起止时间主要工作内容2021年10月-2021年12月实验前期准备，定购试剂、耗材、大鼠，预实验。2021年1月-2021年3月完成实验一：手术造模、依各时间点脑组织取材，测定脑含水量、RT-PCR方法测定TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表达。2021年4月-2021年6月完成实验二：手术造模、依各时间点脑组织取材，冠状脑切片行HE染色病理观察，免疫组化法检测TLR4、TNF-α、AQP4蛋白。2021年6月-2021年7月整理数据，统计分析。2021年7月-2021年10月撰写论文、投稿。实验经费预算1、专用业务费：1〕标本、样品采集加工费：5000元2〕测试费：6500元3〕试验动物养殖费：250×2×7=3500元4〕其他〔管理费、协作费、劳务费、论文版面费〕：5000元2、原材料费：1〕RT-PCR试剂〔Trizol、DEPC、DNaseⅠ、逆转录试剂盒、微量加样枪、TLR4、TNF-α、AQP4及内