oxldl-ab的i标记及体外稳定性和活性评价

oxldl-ab的i标记及体外稳定性和活性评价

动脉硬化（as）是导致各种心脑血管疾病的主要原因。它是在某些异常情况下,血管内皮发生损伤,刺激巨噬细胞释放炎症因子,血浆中的低密度脂蛋白(LowdensityLipoprotein,LDL)载带胆固醇经过损伤处时,被炎症因子等氧化修饰成氧化低密度脂蛋白(OxidizedLowdensityLipoprotein,OxLDL),巨噬细胞通过清道夫途径识别并吞噬OxLDL,并吸收其载带的胆固醇而膨胀形成泡沫细胞,并渐渐积累形成粥样斑块;OxLDL是AS全病程中重要的标志物,并且与高血压等疾病密切相关。OxLDL作为抗原刺激机体产生的自身抗体是氧化低密度脂蛋白单克隆抗体(AntioxidizedLowdensityLipoproteinMonoclonalAntibody,OxLDL-Ab)。根据125I标记的单克隆抗体与抗原物质定量反应,可以使体内存在的抗原物质得以常规化检测,这对受检者的临床诊断和治疗有实际意义。目前,国外已有OxLDL-Ab的酶联免疫试剂盒出售,国内已有OxLDL半定量试纸专利,但尚无OxLDL-Ab放免试剂盒的研究报道。鉴于放免试剂盒具有结果可靠、简便易行、成本低廉并具有高灵敏度、高特异性等优点,本研究拟采用放射性核素125I标记抗OxLDL-Ab,评价125I-OxLDL-Ab与OxLDL结合的活性,为抗OxLDL-Ab用于AS体外诊断放免试剂盒的研究提供实验基础。1实验部分1.1聚天平pd-10柱型GAMMAC12γ计数器:美国DPC公司产品;RM-905a型活度计:中国计量科学研究院产品;AR2130型电子天平:美国OHAUS公司产品;单道可调移液器:美国Eppendorf公司产品;PD-10柱:瑞典AmershamBioscience公司产品;WhatmanNo.1试纸:英国Whatman公司产品。1.2小鼠钥孔虫基因OxLDL-Ab:1.228g/L,成都华神生物技术有限责任公司提供;牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA):北京博奥森生物技术有限公司产品;Na125I溶液:放射性浓度为13TBq/L,美国PerkinElmerLifeScience公司产品;小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白(MouseKeyholeLimpetHemocyanin,KLH):SigmaAldrich公司产品。其它化学试剂均为分析纯,购自北京化学试剂公司。1.3标记的纯化和鉴定采用Iodogen法进行标记。将81μLOxLDL-Ab的PBS溶液(0.2mol/L,pH7.4,含40μgOxLDL-Ab)置于Iodogen管中,加入9.25MBqNa125I溶液,用0.2mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液(PB)调反应体积至200μL,振摇反应8min,移出反应液,停止反应。用PD-10柱层析法对标记液进行纯化。以0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液为淋洗液,流速控制在每分钟约6滴,按每管0.2mL收集洗脱液,并测量放射性活度。采用纸色谱法测定125I-OxLDL-Ab的标记率和放化纯度。分别将纯化前的反应液和纯化后的产物用WhatmanNo.1试纸测定,以V(甲醇)∶V(水)=85∶15溶液为展开剂。1.41盐水与人血清三种生物体系放化纯度的测定将400μL放化纯度为96%、放射性比活度为24TBq/g的125I-OxLDL-Ab,分别置于生理盐水、含2%BSA的生理盐水和人血清3种体系,各体系一式3份,分别置于4、10和37℃存放,分别于放置后1、2、18h和1、2、3、4、6、7d取样,用纸色谱法测其放化纯度。1.5标准样的制备125I-OxLDL-Ab与其抗原KLH的结合实验采用96孔板法。用100μL0.05g/LKLH包被液包被96孔板,于4℃放置过夜,弃去孔内液体并用200μL含0.1%BSA的PBS(pH7.4,0.01mol/L)洗涤3次;每孔加入200μL含2%BSA的PBS封闭,37℃孵育1h,使没有结合的多余位点完全封闭,如上方法洗涤;将125I-OxLDL-Ab(96%,41.4PBq/mol)按倍比稀释法配成系列浓度,分别与包被的抗原结合,反应平衡后,如上方法洗涤。分别测各孔γ计数,为总结合(TB);测量标准样的放射性计数。非特异性结合(NSB)每孔加入500ng(100μL)OxLDL-Ab,置于37℃下孵育1h后洗涤,测γ计数。2结果与讨论2.1ph对标记率的影响固定OxLDL-Ab为40μg、反应液pH7.4、反应总体积为200μL,观察125I的活度与OxLDL-Ab用量的配比对标记率的影响,结果示于图1。由图1可以看出,当125I的活度与OxLDL-Ab用量的配比为92.5GBq/g时,标记率最高,因此,选取125I的活度与OxLDL-Ab用量的配比范围为37～185GBq/g。固定OxLDL-Ab用量为40μg、125I的用量为3.7MBq,分别加入pH为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0的PB缓冲液,使反应总体积为200μL,反应8min,观察缓冲液的pH对标记的影响,结果示于图2。由图2可以看出,pH为7.4～7.8时,标记率较高,达到79%～81%,由于抗体溶解于pH7.4的PBS溶液,因此,选用pH7.4的缓冲体系。固定OxLDL-Ab为40μg、125I3.7MBq、pH7.4、总反应体积200μL,分别于反应开始后2、4、6、8、10、12、14、16和18min取样,测定标记率,结果示于图3。由图3可以看出,4min后反应已基本达到平衡,延长反应时间,标记率没有明显提高,却可能影响抗体的活性,因此控制反应时间为4～10min。取Iodogen管,分别加入20、40、80、160和320μgOxLDL-Ab和18.5、37、74、148和296kBq125I,固定1.3节中的其它反应条件,观察OxLDL-Ab用量对标记率的影响,结果示于图4。由图4可以看出,OxLDL-Ab的用量低于160μg时均可获得较高的标记率,>80%。2.2标记液的洗脱曲线根据2.1节选择最佳标记条件为:125I活度与OxLDL-Ab的用量配比的比为37～185GBq/g、pH7.4～7.8、反应时间4～10min、抗体用量20～160μg。在此条件下对OxLDL-Ab进行125I的标记。标记液的洗脱曲线示于图5。由图5可以看出,洗脱后得两峰,前者为标记产物125I-OxLDL-Ab峰,后者为杂质峰,对比Na125I溶液的洗脱曲线可知为游离碘峰。由此曲线计算得标记率>80%。用纸色谱法分析标记液,125I-OxLDL-Ab的Rf为0.0～0.2;杂质的Rf>0.5,其中游离碘的Rf为0.6～0.9。据此计算得标记率>80%,这与洗脱曲线分析结果一致;放化纯度为95%;比活度为73.3GBq/g。2.31理盐水、牛血清白蛋白和人血清三应体125I-OxLDL-Ab在不同介质中的体外稳定性列于表1。由表1可以看出,标记物在生理盐水、牛血清白蛋白和人血清三种体系中,分别在4、10和37℃下放置72h,放化纯度降低小于5%;各体系在4℃下放置96h后放化纯度降低仍小于5%,且相对标准差均小于5%,因此125I-OxLDL-Ab的体外稳定性良好,适宜在4℃冰箱中贮存。2.31标记抗体与dl-ab的比例对scatchird进行的影响用prism5.0生物做图软件做饱和曲线和Scatchard图,结果示于图6。对于一定数量的抗原KLH来说,其亲和力是固定的,当125I-OxLDL-Ab的浓度从零开始上升时,125I-OxLDL-Ab-KLH复合物的量先是上升很快,后渐渐变慢,在加入标记抗体的浓度达49.67pmol/L时,绝大多数固定抗原被饱和;Scatchard图呈线性(r2>0.95),说明125I-OxLDL-Ab与相应抗原结合反应的比例为1∶1。通过计算得Ka为10.6±1.3GL/mol,说明该标记抗体与其抗原具有特异活性,亲和力好(一般抗体-抗原的Ka为0.1～10GL/mol)。3体外as诊断试验125I-OxLDL-Ab的标记率和放化纯度高、